Etablering av Viral infeksjon og analyse av Host-Virus samhandling i Drosophila Melanogaster
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter viral infeksjon i vivo i Drosophila melanogaster bruker nano-injeksjon metoden og grunnleggende teknikker for å analysere virus vert interaksjon.
Abstract
Viruset sprer seg er en viktig årsak til epidemien sykdommer. Dermed forstå samspillet mellom viruset og vert er svært viktig å utvide vår kunnskap om forebygging og behandling av virusinfeksjon. Frukt fly Drosophila melanogaster har vist seg for å være en av de mest effektive og produktive modell organismene å skjermen for antiviral faktorer og undersøke virus vert interaksjon, kraftige genetisk verktøy og høyt konservert medfødte immunsystemet signalveier. Fremgangsmåten som er beskrevet her viser en nano-injeksjon metode for å etablere viral infeksjon og indusere systemisk antiviral svar i voksen fluer. Presis kontroll av viral injeksjon dosen i denne metoden gjør det mulig for høyt eksperimentell reproduserbarhet. Protokoller som er beskrevet i denne studien omfatter utarbeidelse av fluer og viruset, injeksjon metoden, survival rate analyse, viruset belastning målingen og en antiviral veien vurdering. Innflytelse effekten av viral infeksjon av fluene bakgrunn ble nevnt her. Denne infeksjon metoden er enkel å utføre og kvantitativt repeterbare; Det kan brukes å skjermen for vert/viral faktorer virus vert samhandlingen og dissekere crosstalk mellom medfødte immunsystemet signalering og andre biologiske banene svar på virusinfeksjon.
Introduction
Emerging viral infeksjoner, spesielt av arboviruses, som den Chikungunya virus1, Dengue virus, gulfeber virus2 og Zikavirus3, har blitt en stor trussel mot folkehelsen ved forårsaker pandemier 4. dermed en bedre forståelse av virus-vert interaksjon har blitt stadig viktigere for epidemien kontroll og behandling av sykdommer hos mennesker. For dette målet, må mer hensiktsmessig og effektiv modeller opprettes undersøke mekanismene bak virusinfeksjon.
Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), gir et kraftig system for å undersøke virus vert samhandling5,6 og har vist seg for å være en av de mest effektive modellene å studere menneskelige sykdommer7 , 8 , 9. høyt konservert antiviral signalnettverk trasé og makeløs genetisk verktøy gjør flyr en flott modell å produsere betydelige resultater med reelle konsekvenser for menneskelig antiviral studier. I tillegg fluer er enkelt og billig å opprettholde i laboratoriet og er praktisk for store screening av romanen regulatoriske forhold6,10 i viruset og vert under infeksjon.
Fire store høyt konservert antiviral veier (f.eks., RNA forstyrrelser (RNAi) veien11, JAK-STAT veien12, NF-κB veien og autophagy veien13) er godt studert i Drosophila i siste år6. RNAi veien er en bred antiviral mekanisme som kan undertrykke de fleste typer virus infeksjon6,14. Forstyrrelse av denne veien av mutasjon i gener som Dicer-2 (Dcr-2) eller Argonaute 2 (AGO2) kan føre til økt virus titer og vert dødelighet15,16,17. JAK-STAT veien har vært innblandet i kontroll av infeksjon av virus fra Dicistroviridae familien og Flaviviridae familien i insekter, f.eks., Drosophila C-viruset (DCV) flyr16 og West Nile virus (WNV) og Dengue Virus i mygg18,19. Drosophila Toll (homologe til menneskelig NF-κB veien) og immunforsvarsvikt (IMD) veier (ligner menneskelige NF-κB og TNF veien) er involvert i å forsvare virus invasjonen20,21, 22. autophagy er en annen bevarte mekanisme involvert i regulering av virusinfeksjon, som er godt preget i Drosophila23,24. Dermed identifikasjon av romanen regulatoriske forhold av disse stier og dissecting crosstalk mellom disse antiviral signalering og andre biologiske banene, som metabolisme, aldring, neural reaksjon og så videre, kan enkelt defineres i Drosophila system.
Selv om mest veletablerte viral smittsomme modeller i Drosophila er indusert av RNA virus, infeksjon av virvelløse iriserende Virus 6I (IV-6) og Kallithea virus har vist potensialet for studier av DNA virus i fluer25, 26. Videre kan viruset også endres for å tillate infeksjon i Drosophila, for eksempel influensavirus9. Dette er betydelig utvidet bruk av Drosophila screening plattformen. Her bruker vi DCV som et eksempel for å beskrive hvordan å utvikle en viral smittsomme system i Drosophila. DCV er en positiv-følelse enkelt strandet RNA virus av ca 9300 nukleotider, koding 9 proteiner27. Som en naturlig patogen av D. melanogasteranses DCV som et passende virus å studere vert fysiologiske, adferd og basale immunrespons i verten-virus samhandling og samtidig evolusjon28. I tillegg gjør sin raske dødelighet etter infeksjon i vill type fluer DCV nyttig å skjermen for motstandsdyktig eller utsatt gener i vert29.
Men er det flere aspekter av bekymring når studere virusinfeksjoner i Drosophila. For eksempel har symbiotiske bakterier Wolbachia en evne for å hemme et bredt spektra av RNA-virus spredning i Drosophila og mygg30,31,32. Nyere bevis viser en mulig mekanisme som Wolbachia blokker Sindbis (SINV) smitte gjennom oppregulering av methyltransferase Mt2 uttrykk i de vert33. I tillegg er genetisk bakgrunn av insekter også avgjørende for virusinfeksjon. Den naturlige polymorfisme i genet, pastrel (pst), bestemmer for eksempel mottakelighet for DCV infeksjon i Drosophila34,35, mens loci Ubc-E2H og CG8492 er involvert i Cricket lammelse virus (CrPV) og Flock hus (FHV) smitte, henholdsvis36.
Den bestemte måten å etablere virus vert samspillet i fluer, må velges i henhold til forskningsformål som en høy gjennomstrømming skjerm for verten cellulære komponenter i Drosophila cellen linjer37,38, muntlig infeksjon å studere gut-spesifikk antiviral reaksjon22,39,40, nål pricking41,42 eller nano-injeksjon ved å sende epithelial barrierer for å stimulere systemisk immun svar. Nano-injeksjon kan nettopp kontroll viral dose for å indusere en kontrollert antiviral reaksjon og en fysiologisk lesjon43, dermed garantere høyt eksperimentell reproduserbarhet44. I denne studien beskriver vi en nano-injeksjon metode for å studere viruset vert interaksjoner i Drosophila, fremheve betydningen av fluene bakgrunn effekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen presenterer vi en detaljert prosedyre på hvordan å etablere en viral smittsomme system i voksen Drosophila melanogaster med nano-injeksjon. Protokollene inkluderer utarbeidelse av aktuelle fly linjer og virus lager, infeksjon teknikker, evaluering av smittsomme indikatorer og måling av antivirale svaret. Selv om DCV er brukt som et eksempel på en viral patogen, er titalls ulike typer virus vellykket brukt for studier i Drosophila systemet. I tillegg har hundrevis av regulatoriske forhold, …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gjerne takke hele Pan lab i IPS. CAS. Vi takker Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) for eksperimentell hjelp og Dr. Gonalo Cordova Steger (Springer natur), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) og Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) for kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra strategiske prioritet forskningsprogrammet av det kinesiske vitenskapsakademi L.P (XDA13010500) og H.T (XDB29030300), National Natural Science Foundation i Kina L.P (31870887 og 31570897) og J.Y (31670909). L.P er medlem av CAS Youth innovasjon Promotion Association (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Referências
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genética. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genética. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genética. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
