Estabelecimento de infecção Viral e análise da interação vírus-hospedeiro em Drosophila Melanogaster.
Summary
Este protocolo descreve como estabelecer infecção viral na vivo em Drosophila melanogaster , usando o método de nano-injeção e técnicas básicas para analisar a interação vírus-hospedeiro.
Abstract
Propagação do vírus é das principais causas de doenças epidêmicas. Assim, compreender a interação entre o vírus e o hospedeiro é muito importante para estender o nosso conhecimento de prevenção e tratamento da infecção viral. A mosca de fruta Drosophila melanogaster provou para ser um dos organismos modelo mais eficiente e produtiva de tela para fatores antivirais e investigar a interação vírus-hospedeiro, devido a ferramentas poderosas de genéticas e altamente conservada imune inata vias de sinalização. O procedimento descrito aqui demonstra um método de nano-injeção para estabelecer a infecção viral e induzir respostas antivirais sistêmicas em moscas adultas. O controle preciso da dose injeção viral neste método permite alta reprodutibilidade experimental. Os protocolos descritos neste estudo incluem a preparação de moscas e o vírus, o método de injeção, análise de taxa de sobrevivência, a medição de carga de vírus e uma avaliação do percurso antiviral. Os efeitos da influência da infecção viral pelo fundo dos moscas foram mencionados aqui. Este método de infecção é fácil de executar e quantitativamente repetíveis; pode ser aplicado para a tela para anfitrião/viral factores envolvidos na interação vírus-hospedeiro e dissecar o crosstalk entre imune inata de sinalização e outras vias biológicas em resposta à infecção viral.
Introduction
Emergentes de infecções virais, especialmente por arbovírus, tais como o vírus de Chikungunya1, o vírus da Dengue, a febre amarela vírus2 e ovírusZika3, ter sido uma enorme ameaça para a saúde pública, causando pandemias 4. assim, uma melhor compreensão da interação vírus-hospedeiro tornou-se cada vez mais importante para o controle de epidemia e tratamento de doenças virais nos seres humanos. Para este objetivo, modelos mais apropriados e eficientes devem ser estabelecidos para investigar os mecanismos subjacentes a infecção pelo vírus.
Mosca da fruta, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fornece um sistema poderoso para investigar de5,de interação vírus-hospedeiro6 e tem provado para ser um dos modelos mais eficientes para estudar doenças humanas virais7 , 8 , 9. antiviral altamente conservada, sinalização de caminhos e ferramentas de genéticas incomparáveis fazem voa um grande modelo para produzir resultados significativos com implicações reais para estudos antivirais humanos. Além disso, moscas são fáceis e baratas de manter no laboratório e são convenientes para triagem em larga escala de novos fatores regulatórios6,10 no vírus e o hospedeiro durante a infecção.
Quatro principais vias antivirais altamente conservadas (ex., o RNA de interferência (RNAi) via11, o JAK-STAT caminho12, via NF-κB e a caminho de autofagia13) são bem estudados em Drosophila nos últimos anos6. A via RNAi é um mecanismo antiviral amplo que pode suprimir a maioria dos tipos de vírus infecção6,14. Este caminho por mutações nos genes como Dicer-2 (Dcr-2) ou Argonaute 2 (AGO2) podem levar ao aumento de vírus título e host mortalidade15,16,17. O pathway JAK-STAT tem sido implicado no controle da infecção por um vírus da família Dicistroviridae e família Flaviviridae em insetos, por exemplo., vírus C drosófila (DCV) em moscas16 e vírus do Nilo Ocidental (WNV) e o vírus da Dengue em mosquitos18,19. O pedágio da drosófila (homólogo ao pathway NF-κB humana) e percursos de deficiência imunológica (IMD) (semelhantes ao humano pathway NF-κB e TNF) estão envolvidos na defesa de vírus invasão20,21, 22. autofagia é outro mecanismo conservado envolvidos na regulação da infecção viral, que é bem caracterizada em Drosophila23,24. Assim, a identificação de fatores regulatórios novela destas vias e dissecação crosstalk entre estes sinalização antiviral e outros caminhos biológicos, tais como metabolismo, envelhecimento, reação neural e assim por diante, podem ser facilmente configurados na drosófila sistema.
Embora modelos de infecciosos virais mais bem estabelecidos em drosófila são induzidos por vírus de RNA, infecção pelos invertebrados iridescente vírus 6I (IV-6) e vírus de Kallithea demonstraram o potencial para o estudo dos vírus de DNA em moscas25, 26. Além disso, o vírus também pode ser modificado para permitir a infecção de Drosophila, tais como o vírus da gripe9. Isto expandiu-se enormemente a aplicação da plataforma de triagem de Drosophila . Neste procedimento, usamos DCV como exemplo para descrever como desenvolver um sistema infeccioso viral em Drosophila. DCV é um positivo-sentido único encalhado RNA vírus de aproximadamente 9300 nucleotídeos, codificação de proteínas 927. Como um patógeno natural de d. melanogaster, DCV é considerado como um vírus adequado para estudar a resposta imune do hospedeiro fisiológicos, comportamentais e basal durante hospedeiro-vírus interação e co-evolução28. Além disso, sua taxa de mortalidade rápida após infecção em moscas do tipo selvagem torna DCV útil para triagem de genes resistentes ou suscetíveis no anfitrião29.
No entanto, há vários aspectos de preocupação quando estudar infecções virais em Drosophila. Por exemplo, bactérias simbióticas Wolbachia têm uma capacidade de inibir uma ampla espectros de proliferação de vírus de RNA em Drosophila e mosquito31,de30,32. Evidência recente mostra um possível mecanismo no qual Wolbachia blocos Sindbis vírus (SINV) infecção através o upregulation do methyltransferase Mt2 expressão no anfitrião33. Além disso, o fundo genético de insetos também é fundamental para a infecção viral. Por exemplo, o natural polimorfismo no gene, pastrel (pst), determina a suscetibilidade à infecção de DCV em Drosophila34,35, enquanto Locus E2H-Ubc e CG8492 estão envolvidos em vírus de paralisia de Cricket (CrPV) e infecção por vírus (FHV) rebanho casa, respectivamente,36.
Os modos particulares para estabelecer a interação vírus-hospedeiro em moscas, deve ser escolhido de acordo com fins de investigação, tais como uma tela de alta produtividade para componentes celulares do hospedeiro em Drosophila célula linhas37,38, oral infecção para estudar a resposta antiviral específico do intestino22,39,40, agulha picando41,42 ou nano-injeção, passando as barreiras epiteliais para estimular imune sistêmica respostas. Nano-injeção pode controlar com precisão a dose viral para induzir uma reação antiviral controlada e uma lesão fisiológica43, garantindo alta reprodutibilidade experimental44. Neste estudo, descrevemos um método de nano-injeção para estudar interações do vírus-anfitrião em Drosophila, destacando a importância dos efeitos de fundo dos moscas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste artigo, apresentamos um procedimento detalhado sobre como estabelecer um sistema viral infeccioso em adultos Drosophila melanogaster , usando nano-injeção. Os protocolos incluem a preparação de linhas apropriadas de voar e estoque de vírus, técnicas de infecção, a avaliação dos indicadores de infecciosas e a medição da resposta antiviral. Apesar de DCV é usado como um exemplo de um patógeno viral, dezenas de tipos diferentes de vírus foi bem sucedidas para estudo no sistema da drosófila. Al…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer o laboratório Pan todo em IPS. CAS. Agradecemos o Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) para assistência experimental e Dr. Gonalo Cordova Steger (natureza de Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Paris) e Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) para comentários. Este trabalho foi apoiado por concessões do programa estratégico de pesquisa prioritárias da Academia Chinesa de Ciências L.P (XDA13010500) e h. t (XDB29030300), a Fundação ciência Natural nacional da China para L.P (31870887 e 31570897) e J.Y (31670909). L.P é um membro da Associação de promoção de inovação do CAS da juventude (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
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