Создание вирусной инфекции и анализа взаимодействия хост вирус в Drosophila Melanogaster
Summary
Этот протокол описывает в Drosophila melanogaster с использованием нано инъекционный метод и основные методы для анализа взаимодействия вируса узла создать вирусной инфекции в естественных условиях .
Abstract
Вирус распространяется является одной из основных причин эпидемических заболеваний. Таким образом понимание взаимодействия между вирусом и принимающей страны очень важно расширить наши знания о профилактики и лечения вирусной инфекции. Плодовой мушки Drosophila Меланаogaster оказался одним из наиболее эффективных и продуктивных модельных организмов экрана для противовирусное факторов и изучения взаимодействия вируса хост, из-за генетических мощные инструменты и высоко сохраняется врожденный иммунный сигнальные пути. Процедуру, описанную здесь демонстрирует метод нано инъекции для установления вирусной инфекции и побудить системных противовирусное ответы взрослых мух. Точный контроль вирусных инъекций доза в этот метод позволяет высокую воспроизводимость экспериментальной. Протоколы, описанные в данном исследовании включают подготовку мух и вирус, метод впрыска, выживание курс анализа, измерения нагрузки вирус, и противовирусное путь оценки. Влияние последствий вирусной инфекции на фоне мухи были упомянуты здесь. Этот метод инфекции легко выполнять и количественно повторяемости; Он может применяться для хост/вирусные факторы взаимодействия вируса хост и вскрыть перекрестных помех между врожденной иммунной сигнализации и другие биологические пути в ответ на вирусную инфекцию.
Introduction
Новые вирусные инфекции, особенно путем арбовирусов, таких, как вирус чикунгуньи1, вирус денге, желтой лихорадки вирус2 ивирусЗика3, были огромную угрозу для общественного здоровья, вызывая пандемий 4. Таким образом, более глубокого понимания взаимодействия вируса хост становится все более важным для эпидемического контроля и лечения вирусных заболеваний в организме человека. Для этой цели необходимо создать более адекватных и эффективных моделей для изучения механизмов лежащие в основе вирусной инфекции.
Плодовая муха, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), обеспечивает мощную систему для изучения вируса хост взаимодействия5,6 и оказался одним из наиболее эффективных моделей для изучения вирусных заболеваний человека7 , 8 , 9. высоко сохранены противовирусное, сигнальные пути и несравненный генетических инструменты делают мухи большой модели для получения существенных результатов с реальные последствия для человека антивирусных исследований. Кроме того мух, простой и недорогой для поддержания в лаборатории и удобны для крупномасштабных скрининг Роман регуляторные факторы6,10 вирус и принимающей во время инфекции.
Четыре основных высоко сохранены противовирусное пути (например., РНК интерференции (RNAi) путь11, Як-STAT путь12, NF-κB путь и путь autophagy13) хорошо изучены в дрозофила в последние лет6. Интерференции является широкий противовирусное механизмом, который может подавить большинства видов вирусной инфекции6,14. Нарушение этого пути, мутации в генах как Dicer-2 (Dcr-2) или Argonaute 2 (давности2) может привести к увеличению вирус титр и принимающих смертности15,16,17. Як-STAT путь был вовлечен в контроля инфекции вирусом из семьи Dicistroviridae и Flaviviridae семьи в насекомые, например., дрозофила C вирус (DCV) в16 мух и вирус Западного Нила (ВЗН) и вирус денге комаров18,19. Дрозофилы платных (гомологичных человека NF-κB путь) и иммунодефицит (IMD) тропы (похож на человеческий путь NF-κB и TNF) являются оба участвовали в защите вирусов вторжения20,21, 22. autophagy это еще сохраняется механизм, участвует в регуляции вирусной инфекции, которая характеризуется хорошо дрозофилы23,24. Таким образом, идентификация Роман регуляторные факторы этих путей и рассечения перекрестных помех между этими противовирусное сигнализации и другие биологические пути, таких как метаболизм, старение, нейронные реакции и так далее, можно легко настроить в дрозофилы системы.
Хотя наиболее устоявшихся вирусных инфекционных модели в дрозофилы индуцированных РНК-вирусов, инфекции, беспозвоночных радужные вирус 6I (IV-6) и Калифея вирусы продемонстрировали потенциал для исследования ДНК вирусов в мух25, 26. Кроме того вирус может также быть изменен инфекции дрозофилы, таких как вирус гриппа9. Это значительно расширил применение дрозофилы скрининг платформы. В этой процедуре мы используем DCV в качестве примера для описания как развивать систему вирусных инфекционных дрозофилы. DCV представляет собой положительный смысл единого мель РНК вирус примерно 9300 нуклеотидов, кодирование 9 белки27. Как естественный возбудитель D. melanogasterDCV считается подходящим вирус изучать физиологические, поведенческие и базальной иммунного ответа во время пребывания вирус взаимодействия и коэволюции28. Кроме того его быстрого смертности после инфицирования в дикого типа мух делает DCV полезным экран для устойчивостью или подверженных генов в принимающей29.
Однако есть несколько аспектов озабоченности при изучении вирусных инфекций у дрозофилы. К примеру симбиотические бактерии Wolbachia имеют способность ингибировать широкого спектра РНК вируса распространения дрозофилы и комаров30,,3132. Последние данные показывает возможный механизм, в котором Wolbachia блоков синдбис вирус (SINV) инфекции через upregulation метилтрансфераза Mt2 выражение в принимающей33. Кроме того генетический фон насекомых также имеет решающее значение для вирусной инфекции. К примеру, естественный полиморфизм гена pastrel (pst), определяет восприимчивость к инфекции DCV дрозофилы34,35, хотя локусов Ubc-E2H и CG8492 участвуют в крикет паралич вирус (CrPV) и стадо заражения вирусом (FHV) дом, соответственно36.
Конкретных способов установить вирус хост взаимодействия в мух, должны быть выбраны согласно научно-исследовательских целей, таких как экран высокой пропускной способностью для принимающей клетчатых компонентов в дрозофилы клеток линии37,38, устные -инфекции обучения гут конкретных противовирусное ответ22,39,40, иглы, покалывание41,42 или нано инъекции, передав эпителиальных барьеры для стимулирования системной иммунной ответы. Нано инъекции можно точно контролировать вирусный доза побудить контролируемых противовирусное реакции и физиологических поражения43, таким образом гарантируя высокую воспроизводимость экспериментальной44. В этом исследовании мы описываем метод нано инъекции для изучения взаимодействия вирус хост у дрозофилы, подчеркнув важность эффекты фона мух.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этой статье мы представляем подробную процедуру о том, как создать вирусный инфекционных систему в взрослых Drosophila melanogaster с использованием нано инъекции. Протоколы включают подготовку соответствующих летать линий и вирус фондовой, инфекции методов, оценки инфекционных показате…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить весь Пан лаборатории в IPS. CAS. Мы благодарим Ванг Lanfeng (IPS, CAS) для экспериментальной помощи и доктор Gonalo Cordova Steger (Springer природы), доктор Джессика Варгас (IPS, Париж) и доктор Seng Чжу (IPS, Париж) для комментариев. Эта работа была поддержана грантов из стратегических приоритетных исследований программы Китайской академии наук L.P (XDA13010500) и H.T (XDB29030300), Национальный фонд естественных наук Китая L.P (31870887 и 31570897) и J.Y (31670909). L.P является членом CAS молодежных инноваций ассоциации (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Referências
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genética. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genética. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genética. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
