Inrättandet av virusinfektion och analys av värd-Virus interaktion i Drosophila Melanogaster
Summary
Det här protokollet beskriver hur du upprättar virusinfektion i vivo i Drosophila melanogaster använder nano-injektion metod och grundläggande tekniker för att analysera virus-host interaktion.
Abstract
Virus sprids är en viktig orsak till epidemiska sjukdomar. Thus, förstå samspelet mellan virus och värd är mycket viktigt att utvidga vår kunskap om förebyggande och behandling av viral infektion. Bananflugan Drosophila melanogaster har visat sig vara en av de mest effektiva och produktiva modellorganismerna skärm för antivirala faktorer och undersöka virus-host interaktion, tack vare kraftfulla verktyg för genetiska och mycket medfödda immunförsvaret signalvägar. Den procedur som beskrivs här visar en nano-injektion metod för att fastställa virusinfektion och inducera systemisk antivirala svar i vuxna flugor. Exakt kontroll av viral injektion dosen i denna metod möjliggör hög experimentell reproducerbarhet. Protokoll som beskrivs i denna studie inbegripa förberedelse av flugor och viruset, metoden injektion, klassar överlevnadsanalys, virus belastning mätning och en antiviral utbildningsavsnitt bedömning. Inflytande effekterna av virusinfektion av flugorna bakgrunden nämndes här. Denna infektion metod är enkel att utföra och kvantitativt repeterbara; Det kan användas till skärmen för värd/viral faktorer som är inblandade i virus-host interaktion och att dissekera överhörning mellan medfödd immun signalering och andra biologiska spridningsvägar som svar på virusinfektion.
Introduction
Framväxande virusinfektioner, speciellt av arboviruses, såsom den Chikungunya virus1, denguefeber virus, den gula feber-virus2 och den Zikavirus3, har varit ett stort hot mot folkhälsan genom att orsaka pandemier 4. alltså en bättre förståelse för virus-host interaktion har blivit allt viktigare för epidemiska kontroll och behandling av virussjukdomar hos människor. För detta mål, måste mer lämpliga och effektiva modeller inrättas för att undersöka mekanismerna bakom virusinfektion.
Bananflugan, Drosophilamelanogaster (D. melanogaster), ger ett kraftfullt system för att undersöka virus-host interaktion5,6 och har visat sig vara en av de mest effektiva modellerna att studera mänskliga virussjukdomar7 , 8 , 9. mycket antiviral signalering vägar och makalös genetiska verktyg gör flugor en bra modell för att producera betydande resultat med verkliga konsekvenser för antivirala studier på människa. Dessutom flugor är enkla och billiga att underhålla i laboratorium och är praktiskt för storskalig undersökning av romanen reglerande faktorer6,10 i viruset och värden under infektion.
Fyra stora mycket antivirala vägar (t.ex., RNA interferens (RNAi) väg11, JAK-STAT väg12, NF-κB vägen och autofagi väg13) är väl studerat i Drosophila i senaste år6. RNAi stigen är en bred antivirala mekanism som kan dämpa de flesta typer av virus infektion6,14. Störningar i denna väg av mutation i gener som Dicer-2 (Dcr-2) eller Argonaute 2 (AGO2) kan leda till ökad virus titer och värd dödlighet15,16,17. Den JAK-STAT-signalvägen har varit inblandade i kontroll av infektion av virus från familjen Dicistroviridae och familjen Flaviviridae i insekter, t.ex., Drosophila C-virus (DCV) flugor16 och West Nile-virus (Moskitbett) och denguefeber Virus i mygga18,19. De Drosophila Toll (homolog till den mänskliga NF-κB vägen) och immunbrist (IMD) vägar (liknar den mänskliga NF-κB och TNF-vägen) är båda engagerade i att försvara virus invasion20,21, 22. autofagi är en annan bevarade mekanism som är involverade i regleringen av virusinfektion, som kännetecknas väl i Drosophila23,24. Således, identifiering av romanen reglerande faktorer av dessa vägar och dissekera överhörning mellan dessa antivirala signalering och andra biologiska spridningsvägar, t ex ämnesomsättning, åldrande, neurala reaktion och så vidare, kan vara enkelt ställa in i den Drosophila systemet.
Även om mest väletablerade viral infektionssjukdomar modeller i Drosophila induceras av RNA-virus, infektion av de ryggradslösa skimrande Virus 6I (IV-6) och Kallithea virus har visat potentialen för studie av DNA virus i flugor25, 26. Dessutom kan viruset också ändras för att tillåta infektion i Drosophila, såsom influensavirus9. Detta har kraftigt utökade tillämpningen av Drosophila screening plattformen. I den här proceduren använder vi DCV som ett exempel för att beskriva hur man utvecklar en viral infektionssjukdomar system i Drosophila. DCV är en positiv-sense enda stranded RNA-virus av cirka 9300 nukleotider, kodning 9 proteiner27. Som en naturlig patogen D. melanogasteranses DCV som lämplig virus studera värd fysiologiska, beteendemässiga och basala immunsvaret under host-virus interaktion och samtidig evolution28. Dessutom gör dess snabba dödligheten efter infektion i vildtyp flugor DCV användbar till skärmen för resistenta eller mottagliga gener i värd29.
Det finns dock flera aspekter av oro när man studerar virusinfektioner i Drosophila. Till exempel har symbiotiska bakterier Wolbachia en förmåga att hämma ett brett spektra av RNA-virus spridning i Drosophila och mygga30,31,32. Senaste belägg visar en möjlig mekanism i vilken Wolbachia block Sindbis virus (SINV) infektion genom uppreglering av methyltransferase Mt2 uttryck i den värd33. Dessutom, är den genetiska bakgrunden av insekter också kritisk för virusinfektion. Exempelvis den naturliga polymorfism i genen, pastrel (pst), bestämmer infektionskänslighet DCV i Drosophila34,35, medan loci Ubc-E2H och CG8492 är involverade i Cricket förlamning virus (CrPV) och Flock hus (FHV) infektion, respektive36.
Den särskilda sätten att fastställa den virus-host interaktionen i flugor, måste väljas enligt forskningsändamål såsom en hög genomströmning skärm för värd cellulära komponenter i Drosophila cell linjer37,38, oral infektion att studera gut-specifika antivirala svar22,39,40, nål prickning41,42 eller nano-injektion av passerar epiteliala hinder för att stimulera systemisk immun Svaren. Nano-injektion kan exakt styra viral dosen för att framkalla en kontrollerad antivirala reaktion och en fysiologisk lesion43, vilket garanterar hög experimentell reproducerbarhet44. I denna studie beskriver vi en nano-injektion metod för att studera virus-host interaktioner i Drosophila, belysa vikten av flugorna bakgrundseffekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna artikel presenterar vi detaljerade anvisningar om hur du upprättar en viral infektionssjukdomar system i vuxen Drosophila melanogaster använder nano-injektion. Protokollen omfattar utarbetandet av lämpliga Fluglinor och virus lager, infektion tekniker, utvärdering av infektiös indikatorer och mätning av antivirala responsen. Även om DCV används som ett exempel på en viral patogen, har tiotals olika sorters virus framgångsrikt tillämpats för studie i Drosophila systemet. Dessutom har hundratal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka hela Pan labbet i IPS. CAS. Vi tackar Dr. Lanfeng Wang (IPS, CAS) för experimental stöd och Dr Gonalo Cordova Steger (Springer natur), Dr Jessica VARGAS (IPS, Paris) och Dr. Seng Zhu (IPS, Paris) för kommentarer. Detta arbete stöds av bidrag från programmet strategisk prioritet forskning av den kinesiska Vetenskapsakademien Larsson (XDA13010500) och Hägg (XDB29030300), den nationella naturvetenskap Foundation i Kina Larsson (31870887 och 31570897) och J.Y (31670909). Larsson är en fellow av CAS ungdom Innovation Promotion Association (2012083).
Materials
| 0.22um filter | Millipore | SLGP033RS | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Brand | 352070 | |
| 1.5 ml RNase free Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | |
| 10 cm cell culture dish | Sigma | CLS430167 | Cell culture |
| 100 Replacement tubes | Drummond Scientific | 3-000-203-G/X | |
| 15 ml tube | Corning | 352096 | |
| ABI 7500 qPCR system | ABI | 7500 | qPCR |
| Cell Incubator | Sanyo | MIR-553 | |
| Centriguge | Eppendof | 5810R | |
| Centriguge | Eppendof | 5424R | |
| Chloroform | Sigma | 151858 | RNA extraction |
| DEPC water | Sigma | 95284-100ML | RNA extraction |
| Drosophila Incubator | Percival | I-41NL | Rearing Drosophila |
| FBS | Invitrogen | 12657-029 | Cell culture |
| flat bottom 96-well-plate | Sigma | CLS3922 | Cell culture |
| Fluorescence microscope | Olympus | DP73 | |
| Isopropyl alcohol | Sigma | I9516 | RNA extraction |
| Lysis buffer (RNA extraction) | Thermo Fisher | 15596026 | TRIzol Reagent |
| Lysis buffer (liquid sample RNA extraction) | Thermo Fisher | 10296028 | TRIzol LS Reagent |
| Microscope | Olympus | CKX41 | |
| Nanoject II Auto-Nanoliter Injector | Drummond Scientific | 3-000-204 | Nanoject II Variable Volume (2.3 to 69 nL) Automatic Injector with Glass Capillaries (110V) |
| Optical Adhesive Film | ABI | 4360954 | qPCR |
| Penicillin-Streptomycin, Liquid | Invitrogen | 15140-122 | Cell culture |
| qPCR plate | ABI | A32811 | qPCR |
| Schneider’s Insect Medium | Sigma | S9895 | Cell culture |
| statistical software | GraphPad Prism 7 | ||
| TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix | TransScript | AT301 | RNA extraction |
| Vortex | IKA | VORTEX 3 | RNA extraction |
Referências
- Rahim, M. A., Uddin, K. N. Chikungunya: an emerging viral infection with varied clinical presentations in Bangladesh: Reports of seven cases. BMC Research Notes. 10, 410 (2017).
- Douam, F., Ploss, A. Yellow Fever Virus: Knowledge Gaps Impeding the Fight Against an Old Foe. Trends in Microbiology. , (2018).
- Santiago, G. A., et al. Performance of the Trioplex real-time RT-PCR assay for detection of Zika, dengue, and chikungunya viruses. Nature Communications. 9. 9, 1391 (2018).
- Gould, E., Pettersson, J., Higgs, S., Charrel, R., de Lamballerie, X. Emerging arboviruses: Why today?. One Health. 4, 1-13 (2017).
- Hughes, T. T., et al. Drosophila as a genetic model for studying pathogenic human viruses. Virology. 423, 1-5 (2012).
- Xu, J., Cherry, S. Viruses and antiviral immunity in Drosophila. Developmental & Comparative Immunology. 42, 67-84 (2014).
- Shirinian, M., et al. A Transgenic Drosophila melanogaster Model To Study Human T-Lymphotropic Virus Oncoprotein Tax-1-Driven Transformation In Vivo. Journal of Virology. 89, 8092-8095 (2015).
- Adamson, A. L., Chohan, K., Swenson, J., LaJeunesse, D. A Drosophila model for genetic analysis of influenza viral/host interactions. Genética. 189, 495-506 (2011).
- Hao, L., et al. Drosophila RNAi screen identifies host genes important for influenza virus replication. Nature. 454, 890-893 (2008).
- Webster, C. L., et al. The Discovery, Distribution, and Evolution of Viruses Associated with Drosophila melanogaster. Plos Biology. 13, e1002210 (2015).
- Heigwer, F., Port, F., Boutros, M. RNA Interference (RNAi) Screening in Drosophila. Genética. 208, 853-874 (2018).
- West, C., Silverman, N. p38b and JAK-STAT signaling protect against Invertebrate iridescent virus 6 infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 14, e1007020 (2018).
- Liu, Y., et al. STING-Dependent Autophagy Restricts Zika Virus Infection in the Drosophila Brain. Cell Host & Microbe. 24, 57-68 (2018).
- Wang, X. H., et al. RNA interference directs innate immunity against viruses in adult Drosophila. Science. 312, 452-454 (2006).
- van Rij, R. P., et al. The RNA silencing endonuclease Argonaute 2 mediates specific antiviral immunity in Drosophila melanogaster. Genes & Development. 20, 2985-2995 (2006).
- Deddouche, S., et al. The DExD/H-box helicase Dicer-2 mediates the induction of antiviral activity in drosophila. Nature Immunology. 9, 1425-1432 (2008).
- Chotkowski, H. L., et al. West Nile virus infection of Drosophila melanogaster induces a protective RNAi response. Virology. 377, 197-206 (2008).
- Paradkar, P. N., Trinidad, L., Voysey, R., Duchemin, J. B., Walker, P. J. Secreted Vago restricts West Nile virus infection in Culex mosquito cells by activating the Jak-STAT pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 18915-18920 (2012).
- Souza-Neto, J. A., Sim, S., Dimopoulos, G. An evolutionary conserved function of the JAK-STAT pathway in anti-dengue defense. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17841-17846 (2009).
- Zambon, R. A., Nandakumar, M., Vakharia, V. N., Wu, L. P. The Toll pathway is important for an antiviral response in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 7257-7262 (2005).
- Costa, A., Jan, E., Sarnow, P., Schneider, D. The Imd pathway is involved in antiviral immune responses in Drosophila. PLoS One. 4, e7436 (2009).
- Ferreira, A. G., et al. The Toll-dorsal pathway is required for resistance to viral oral infection in Drosophila. PLOS Pathogens. 10, e1004507 (2014).
- Moy, R. H., et al. Antiviral autophagy restrictsRift Valley fever virus infection and is conserved from flies to mammals. Immunity. 40, 51-65 (2014).
- Shelly, S., Lukinova, N., Bambina, S., Berman, A., Cherry, S. Autophagy is an essential component of Drosophila immunity against vesicular stomatitis virus. Immunity. 30, 588-598 (2009).
- Bronkhorst, A. W., et al. The DNA virus Invertebrate iridescent virus 6 is a target of the Drosophila RNAi machinery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, E3604-E3613 (2012).
- Palmer, W. H., Medd, N. C., Beard, P. M., Obbard, D. J. Isolation of a natural DNA virus of Drosophila melanogaster, and characterisation of host resistance and immune responses. PLOS Pathogens. 14, e1007050 (2018).
- Jousset, F. X., Bergoin, M., Revet, B. Characterization of the Drosophila C virus. Journal of General Virology. 34, 269-283 (1977).
- Gupta, V., Stewart, C. O., Rund, S. S. C., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. 30, 1325-1335 (2017).
- Yang, S., et al. Bub1 Facilitates Virus Entry through Endocytosis in a Model of Drosophila Pathogenesis. Journal of Virology. , (2018).
- Teixeira, L., Ferreira, A., Ashburner, M. The bacterial symbiont Wolbachia induces resistance to RNA viral infections in Drosophila melanogaster. Plos Biology. 6, e2 (2008).
- Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Science Translational Medicine. 7, 279ra237 (2015).
- Hedges, L. M., Brownlie, J. C., O’Neill, S. L., Johnson, K. N. Wolbachia and virus protection in insects. Science. 322, 702 (2008).
- Bhattacharya, T., Newton, I. L. G., Hardy, R. W. Wolbachia elevates host methyltransferase expression to block an RNA virus early during infection. PLOS Pathogens. 13, e1006427 (2017).
- Magwire, M. M., et al. Genome-wide association studies reveal a simple genetic basis of resistance to naturally coevolving viruses in Drosophila melanogaster. PLOS Genetics. 8, e1003057 (2012).
- Cao, C., Cogni, R., Barbier, V., Jiggins, F. M. Complex Coding and Regulatory Polymorphisms in a Restriction Factor Determine the Susceptibility of Drosophila to Viral Infection. Genética. , 2159-2173 (2017).
- Martins, N. E., et al. Host adaptation to viruses relies on few genes with different cross-resistance properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 5938-5943 (2014).
- Moser, T. S., Sabin, L. R., Cherry, S. RNAi screening for host factors involved in Vaccinia virus infection using Drosophila cells. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Zhu, F., Ding, H., Zhu, B. Transcriptional profiling of Drosophila S2 cells in early response to Drosophila C virus. Journal of Virology. 10, 210 (2013).
- Ekstrom, J. O., Hultmark, D. A Novel Strategy for Live Detection of Viral Infection in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 6, 26250 (2016).
- Durdevic, Z., et al. Efficient RNA virus control in Drosophila requires the RNA methyltransferase Dnmt2. EMBO Reports. 14, 269-275 (2013).
- Chrostek, E., et al. Wolbachia variants induce differential protection to viruses in Drosophila melanogaster: a phenotypic and phylogenomic analysis. PLOS Genetics. 9, e1003896 (2013).
- Gupta, V., Vale, P. F. Nonlinear disease tolerance curves reveal distinct components of host responses to viral infection. Royal Society Open Science. 4, 170342 (2017).
- Chtarbanova, S., et al. Drosophila C virus systemic infection leads to intestinal obstruction. Journal of Virology. 88, 14057-14069 (2014).
- Merkling, S. H., van Rij, R. P. Analysis of resistance and tolerance to virus infection in Drosophila. Nature Protocols. 10, 1084-1097 (2015).
- Goic, B., et al. RNA-mediated interference and reverse transcription control the persistence of RNA viruses in the insect model Drosophila. Nature Immunology. 14, 396-403 (2013).
- Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. . Drosophila: A Laboratory Handbook. , (2011).
- . Biochemical and Biophysical Research Communications: 1991 index issue. Cumulative indexes for volumes 174-181. Biochemical and Biophysical Research Communications. , 1-179 (1991).
- Cotarelo, M., et al. Cytopathic effect inhibition assay for determining the in-vitro susceptibility of herpes simplex virus to antiviral agents. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 44, 705-708 (1999).
- Reed, L. J. M., H, A simple method of estimating fifty percent endpoints. The American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1938).
- Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic bacterial infection and immune defense phenotypes in Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. , e52613 (2015).
- Schwenke, R. A., Lazzaro, B. P. Juvenile Hormone Suppresses Resistance to Infection in Mated Female Drosophila melanogaster. Current Biology. 27, 596-601 (2017).
- Sabin, L. R., Hanna, S. L., Cherry, S. Innate antiviral immunity in Drosophila. Current opinion in immunology. 22, 4-9 (2010).
- Yin, J., Zhang, X. X., Wu, B., Xian, Q. Metagenomic insights into tetracycline effects on microbial community and antibiotic resistance of mouse gut. Ecotoxicology. 24, 2125-2132 (2015).
