Определение нормативных Т-клеток подмножеств в мышиных вилочковой железы, поджелудочной железы, дренаж лимфатических узлов и селезенки, с помощью проточной цитометрии
Summary
Здесь мы представляем протокол подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки для дальнейшего изучения этих клеток с помощью проточной цитометрии. Кроме того этот протокол был использован для определения подмножества регулирующих Т-клеток с помощью проточной цитометрии.
Abstract
Наша иммунная система состоит из числа и разнообразия иммунных клеток, включая нормативные Т-клетки (Treg) клетки. TREG клетки можно разделить на два подмножества, тимуса производных Treg (tTreg) клеток и периферически индуцированных Treg (pTreg) клеток. Они присутствуют в различных органов нашего тела и можно отличить по конкретным маркеров, например Гелиос и Нейропилины 1. Сообщается, что tTreg клетки функционально более подавляющей, чем pTreg клетки. Таким образом важно определить долю tTreg и pTreg клеток при расследовании гетерогенных клеточных популяций. Здесь мы собрали тимуса желез, поджелудочной крылом лимфатических узлов и селезенки от normoglycemic-ожирением диабетических мышей, чтобы отличить tTreg клеток из pTreg клеток с помощью проточной цитометрии. Мы вручную подготовили одну ячейку суспензий от деятельности этих органов. Флюрохром конъюгированных поверхности CD4, CD8, CD25, и 1 Нейропилины антитела были использованы для запятнать клетки. Они хранились в холодильнике всю ночь. На следующий день клетки окрашивали флюрохром конъюгированных внутриклеточных Foxp3 и Гелиос антител. Эти маркеры использовались для характеризуют два подмножества Treg клеток. Этот протокол демонстрирует простой, но практический способ подготовить отдельные ячейки из мышиных вилочковой железы, поджелудочной дренаж лимфатических узлов и селезенки и использовать их для анализа гранулярных последующих потоков.
Introduction
Регуляторных клеток T (Treg) являются критическими для гомеостаза иммунной системы. TREG клетки определяются выражением поверхностных антигенов CD4 и CD25 и транскрипционным фактором forkhead поле P3 (Foxp3)1,2,3. Сакагути et al. впервые показал, что CD25 выражается конститутивно на Т-супрессорной клетки мышей4, который предусматривает новаторские наблюдения для выявления клеток человека Treg. TREG клетки играют центральную роль в иммунной толерантности, оказав подавляющие способность через различные механизмы, включая цитолиза через секрецию granzymes навести apoptosis, цитокин потребления и ингибирование через выражение цитотоксических T-лимфоцитов антигеном 45. Кроме того они могут выделяют ингибирующее цитокины такие преобразования фактор роста бета (TGF-β), интерлейкин-10 (IL-10) и Ил-355. TREG клетки естественным образом могут быть получены из тимуса, в этом случае они обозначаются тимуса производных Treg (tTreg) клеток, или они могут быть вызваны в периферических органов в этом случае называются периферически индуцированных Treg (pTreg) клеток.
Helios, членом семьи фактор транскрипции Ikaros, было сообщено быть маркера для разграничения между tTreg клеток и pTreg клетки6. Позднее две другие группы сообщили, что Нейропилины 1 (Nrp1), semaphorin III-рецептор, может служить поверхности маркера для tTreg клеток при определенных условиях7,8. Тем не менее Singh et al. показали, что Helios является маркер лучше в этом контексте в наивной мышей9.
Подмножества Treg клетки играют ключевую роль в поддержании гомеостаза иммунной системы и защиты от аутоиммунные заболевания и инфекции. Таким образом важно определить количество и долю этих групп населения в лимфоидных и не лимфоидной ткани. Для достижения этой цели, надо подготовить одну ячейку суспензий от деятельности этих органов. Ряд протоколов были описаны или используемых в ходе предыдущих исследований. Главным образом автоматическая Диссоциаторы были использованы в ранее опубликованных докладов10,11. Использование автоматического Диссоциаторы удобно и экономия времени, но она является дорогостоящей процедурой. Таким образом мы использовали ручной метод для подготовки единого клеточных суспензий из мышиных тимуса желез, поджелудочной крылом лимфатические узлы (PDLNs) и селезенки от normoglycemic-ожирением диабетических мышей (НОД) и изолированных клеток одного из этих органов. Этот метод был использован в наших предыдущих исследований, и мы обнаружили, что ручной метод для подготовки одну ячейку подвеска так эффективно, как автоматическая диссоциатором метод9,12,,1314. Кроме того, мы использовали проточной цитометрии для определения соотношения CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg клетки и подмножества Treg клеток tTreg и pTreg клеток. TTreg и pTreg клетки были отделены с помощью Гелиос и Nrp1 как маркеры для tTreg клеток. Таким образом наши результаты показывают, что ручной метод для подготовки единого клетки работать эффективно и суспензий подготовленный одной ячейки могут в дальнейшем использоваться для исследования с использованием проточной цитометрии.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании, мы изолированы единичных клеток железы тимуса, PDLNs и селезенки мышей КИВНУЛ и расследование выражение Гелиос и Nrp1 в CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg клеток с помощью проточной цитометрии. В настоящем исследовании были использованы NOD мышей, который является мо…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Настоящее исследование финансово поддержали Шведский исследовательский совет, EXODIAB, Шведский фонд диабета, Шведский фонд детского диабета, SEB Diabetesfonden и о.е. och Эдла Johanssons vetenskapliga stiftelse. Авторы хотели бы также Спасибо Пер-Ола Карлссон и Стеллан Sandler за их поддерживает и дискуссий.
Materials
| NOD mice | In-house breading | ||
| HBSS | Statens veterinärmedicinska anstalt | 991750 | |
| RPMI-1640 | Sigma-Aldrich | R0883-500ML | |
| NH4Cl | EMD Millipore | 1011450500 | |
| eBioscience Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher | 00-5523-00 | Contains Fixation/Permeabilization Concentrate , Fixation/Permeabilization Diluent and Permeabilization Buffer (10X) |
| eBioscience Flow Cytometry Staining Buffer | ThermoFisher | 00-4222-26 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (RM4-5), FITC, eBioscience | ThermoFisher | 11-0042-85 | |
| CD25 Monoclonal Antibody (PC61.5), PE, eBioscience | ThermoFisher | 12-0251-83 | |
| BD Pharmingen APC-H7 Rat anti-Mouse CD8a | BD Biosciences | 560182 | |
| Mouse Neuropilin-1 APC-conjugated Antibody | R&D Systems | FAB5994A | |
| FOXP3 Monoclonal Antibody (FJK-16s), PE-Cyanine7, eBioscience | ThermoFisher | 25-5773-82 | |
| Pacific Blue anti-mouse/human Helios Antibody | BioLegend | 137220 | |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | CORNING | 352235 | A 35 µm nylon mesh is incorporated into the dual-position snap cap |
| Tube 15ml, 120x17mm, PP | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Micro tube 1.5ml | Sarstedt | 72.690.001 | |
| disposable scintillation vials | WHEATON | ||
| Flow cytometry | BD | ||
| Flow cytometry analysis software | Inivai Technologies | Flowlogic |
Referências
- Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells. Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).
- Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells. Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).
- Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3. Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).
- Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases. The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).
- Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. How regulatory T cells work. Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).
- Weiss, J. M., et al. Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).
- Yadav, M., et al. Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo. Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).
- Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice. Scientific Reports. 5, 7767 (2015).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).
- Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator. Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).
- Singh, K., et al. Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes–possible involvement of regulatory T cells. Scientific Reports. 5, 12633 (2015).
- Digre, A., et al. Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis. Scientific Reports. 7, 46229 (2017).
- Li, X., et al. Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas. Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).
