장 이식-비교-호스트 질병 및 라이브 쥐에서 미니 내 시경 평가의 유도
Summary
여기, 선물이 수용자 조 혈 줄기 세포 이식에 설명 합니다 및 원심 콜론의 반복적인 미니 내 시경 평가 존재, 특성, 그리고 라이브 내 저 승 염증의 심각도 대 한 현장에서 프로토콜 쥐 장 이식-비교-호스트 질병에서 고통.
Abstract
급성 이식-비교-호스트 질병 (GvHD) 가장 심각한 합병증을 환자 이전 수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (여 보세요-HCT) 얼굴 나타내고 빈약한 임상 결과와 자주 연결 됩니다. 예를 들어, GvHD 발현 피부의 설립된 면역 진압 치료에 일반적으로 반응 및, 따라서, 복용 하지 치명적인 코스, 존재와 용기, 중간-낮은 부분 중 특히 장 GvHD의 강도 강하게 승부를 하 고 전반적으로 급성 GvHD. 치료 옵션을 가진 환자의 생존은 본질적으로 고전 면역 진압 요원 양보만 적당 한 질병 완화 효과. 따라서, 조직 상주 면역 폭포에 대 한 상세한 지식을 장 microbiota에 변화와 stromal 응답, 그리고 장 GvHD 발병 후 사전 이벤트 및 기본 메커니즘을 이해 필요가 긴급의 병 인 혁신적인 치료 옵션을 개발 하 고. GvHD의 murine 모델 식별 하 고 기능적으로 평가 하는 분자와 상 장 GvHD 운전 경로 자주 고용 된다. 그러나, 구체적으로 모니터링 하 고 시간이 지남에 장 염증 평가 수단 본질적으로 부족 때문에 평가 하 고 급성 GvHD 학년 설립된 점수는 정기적으로 오히려 조직의 GvHD를 반영 하는 다양 한 매개 변수 구성 발현입니다. 장 GvHD의 상세한 평가를 연구 함으로써 본질적으로 경도 제외 안락사 마우스를 사용 하 여 제한 되었습니다 (즉, 운동) 주어진된 실험 조건 하에서 저 승 구획의 분석 (예를 들어, 항 체 중재 proinflammatory cytokine의 봉쇄) (즉, vivo)에서 살아있는 쥐에서. 여기에 설명 된 여 보세요 HCT 취급 생쥐의 원심 결 장의 미니 내 시경 현장 평가 수 장의 염증과 b)에서 다운스트림 분석에 대 한 조직 샘플을 수집 하는 옵션의 다양 한 측면의 상세한 거시적인 평가 a)를 관측 기간 동안 다양 한 시간 포인트. 전반적으로, 미니 내 시경 접근 전 임상 비 침 투 적인 모니터링 및 평가 장 GvHD의 주요 사전 제공.
Introduction
조 혈 악성 직접 발생 하는 조 혈 줄기 세포 격실에서와 통제, 빠르게 진행, 그리고 심각한 면역 중재 장애는 종종 여 보세요-HCT1,2를 수행 하는 표시. 그러나, 전조 도움이 접목 대 종양 응답의 발생에 대 한 회계, 비록 기증자 세포는 자주 유도 및 홍보 여 보세요-HCT 받는 내 건강 한 조직 구성의 원치 않는 면역 중재 공격 이식-비교-호스트 질병3이라고 하는 프로세스. 발현 용기, 소위 장 GvHD는 심각한 형태의 정기적으로 높은 사망률1,2,4와 관련 된 급성 GvHD의 가장 무시 무시 한 합병증을 나타냅니다.
여 보세요-HCT의 전반적으로, murine 모델 식별 하 고 GvHD5병 기본 면역 중재 메커니즘 연구 귀중 한 도구로 떠오르고 있다. 그러나, 운동 평가, 예를 들어, 라이브 마우스 오버시 소설 치료 개입의 유익한 효과 정기적으로에 따라 임상 GvHD의 결정 점수6. 이러한 점수 반영 하기 위해 적당 한 동안, 예를 들어, 전체 질병 부담 (즉, 조직의 GvHD), 임상 점수 부족 감도 안정적으로 거울 기관 특정 발현을 (예:, 에). 따라서, 예를 들어 이러한 시스템을 일반적으로 점수를 기반으로 하는 특정된 치료 개입의 창 자-보호 효과 대해 결론, 짧은을.
소설 전신의 발명을 통해 주요 발전에도 불구 하 고 이미징 형식 중 발광 또는 형광 유전자 마우스 모델7,8의 사용과 함께 직접 하 고 구체적으로 방법론 평가 장 라이브 쥐에서 GvHD의 형상 부족. 따라서, 다음 섹션에 설명 된 장 GvHD 표현 형의 내 시경 평가의 프로토콜 뒤에 근거는이 장애물을 극복 하는. 또한, 동기 부여는 또한 숫자를 줄이기 위해 실험 쥐 이후, 지금까지, 셀룰러, 형태학, 분자 특성의 상세한 평가 (예:, 분자 생물학 또는 histopathology) 장 GvHD의 징후는 궁극적으로 실험 마우스의 희생을 필요 했다.
우리의 기관 이전 syngeneic colitis 모델9동안 저 승 발현의 미니 내 시경 평가의 방법론에 보도 했다. 여기에 제시 된 프로토콜에서 우리 세련 하 고는 colonoscopic 적응 점수 행렬 alloreactive의 이식 시 장 GvHD와 라이브 쥐에 alloresponse 기반 colitis HCT 및 기증자 세포는 MHC 클래스에서 나 완벽 하 게 일치 하지 않는 설정 . 우리는 장 GvHD 관련 저 승 병 변을 반영 하는 적당 한 4 개의 매개 변수를 확인. 또한, 우리는 쉽게 주어진된 시간에 주어진된 마우스에 장 GvHD의 심각도 대 한 독자에 게 알리는 새로운 점수 결과 어떤 단일 결정의 미세 조정 등급 수 있는 시스템을 설립. Histopathological 분석 특정 임계값 위 내 시경 점수 중간에 높은 급료 조직 염증 예측 안정적으로 확인 했다. 따라서, 미니 내 시경 평가를 일상적으로 실험 쥐의 희생을 요구 하는 표준 histopathology 작업 대신 나타내는 나타납니다. 중요 한 것은,이 프로토콜 거의 모든 주어진된 시간 지점에서 적용 될 수 있습니다 그리고 질병10,11의 과정에서 반복적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 생물 발광 종속 접근의 사용, 반면 유전자 intercrossing 수정 쥐 처럼 아무 노동 강렬 하 고 시간이 많이 소요 조치가 필요 하 고, 따라서, 방법론의 거의 모든 마우스 라인에 적용 될 수 있다 관심입니다.
여 보세요-HCT 환자 심한 장 GvHD의 해로운 임상 관점을 주어 함께 찍은 빠른 과학적 진보와 기본 면역 병 인 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력은 절실히 필요 합니다. 마찬가지로 중요 한, 윤리적인 고려 사항 요구 지식의 이득 실험 쥐의 최소한의 사용으로 달성 되어야. 따라서, 모두 장 GvHD 탐험 연구 커뮤니티에 클레임 모니터링 하 고 라이브 실험 마우스에서 장 GvHD 학년 실험 작업 체인에 콜론의 직렬 미니 내 시경 평가 구현 하 여 고급 수 인정 모델, 설명 하 고 여기에 제시 된 프로토콜에서 검증.
Protocol
Representative Results
Discussion
프로토콜 유도의 방법론과 장 GvHD 동안 관찰 장 형의 미니 내 시경 평가 설명 합니다. 그것은 전체 질병 과정 (즉, 저 승 표현과 최대한 질병 활동까지 진행의 발병)에서 경도 noninvasively 장 GvHD을 공부 하는 과학자의 광범위 한 용도로 사용 됩니다.
그러나, 있다 몇 가지 중요 한 단계와 중요 한 한계는 실험 각각 과학적인 문맥에 기술을 적용 하기 전에 알고 있어야 필요가 제시 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 공동 연구 센터 (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; 프로젝트 B03) (정) 하 고 (정)을 CRC 1181 (CRC-DFG, 프로젝트 B05)에 의해 지원 되었다, 모두 도이치 가운데 (DFG, 독일 연구 재단)에 의해 자금.
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
Referências
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