腸管移植片対宿主病と生きたマウスのミニ内視鏡評価の誘導
Summary
ここでは、同種造血幹細胞移植を説明し遠位結腸の反復的なミニ内視鏡評価、存在、特性、およびライブ内で大腸の炎症の重症度をその場でプロトコルを提案します。マウス腸管移植片対宿主病に苦しんでいます。
Abstract
急性移植片対宿主病 (GvHD) は最も重篤な合併症が患者以前同種造血幹細胞移植 (同種 HCT) 顔を表します、頻繁に悪い臨床結果と関連付けられる。しばらくの間、例えば、皮膚 GvHD 症状は通常確立された免疫抑制療法に反応と致命的なコース、存在および腸の半ば-に-低部分の特に、腸管 GvHD の強度、したがってを取っていません。結果に強く影響、全体的な急性 GvHD。 治療選択肢を患者の生存率は中等度疾患を緩和する効果のみをもたらす古典的な免疫抑制剤に本質的に限られています。したがって、腸内細菌叢の変化組織住民免疫カスケードについての詳細な知識とイベントの基になるメカニズムを理解する前、及び腸管 GvHD 発症後に、間質反応が急務、病因と革新的な治療方法を開発します。GvHD のマウスモデルが頻繁に識別し、分子および推定腸管 GvHD を運転経路を機能的評価に採用します。評価し、グレードの急性 GvHD に確立されたスコアは日常的にむしろ全身 GvHD を反映するさまざまなパラメーターで構成されていますので具体的に監視し、時間をかけて腸内の炎症を評価する手段はない本質的に症状です。消化管 GvHD の詳細な評価は、それによって本質的に縦を除く、安楽死のマウスを用いた研究に制限されている (すなわち、キネティック) 与えられた実験条件下で結腸のコンパートメントの分析 (例えば、抗体炎症性サイトカインの封鎖) (すなわち、生体内) 生きているマウスで。ここで説明した同種 HCT 投与マウスの遠位結腸のミニ内視鏡その場で評価できます) 腸の炎症や b) 下流解析のための組織サンプルを収集するオプションのさまざまな側面の詳細な巨視的評価観察期間のコースを介して様々 な時間ポイント。全体的に、ミニ-内視鏡的アプローチは、臨床非侵襲的モニタリングおよび腸管 GvHD の影響評価の主要な進歩を提供します。
Introduction
直接造血幹細胞コンパートメントからと制御不能を生じた造血器腫瘍、急速に進んでいると重篤な免疫介在性疾患は、しばしば兆候同種 HCT1,2を実行します。しかし、予後の有益な移植片対腫瘍反応の発生の会計処理がドナーのリンパ球がよく誘発・助長する同種 HCT 受信者内の健康な組織のコンポーネントの不要な免疫介在性攻撃、移植片対宿主病3を呼び出されるプロセス。腸、いわゆる腸管 GvHD の症状は、急性 GvHD、重度のフォームは、関連付けられ、高い死亡率1,2,4の最も恐ろしい合併症を表しています。
同種 HCT の全体的なマウスのモデルは、識別や GvHD5病態免疫メカニズムを調査する貴重なツールとして浮上しています。ただし、運動評価の例えば、生きたマウスに時間をかけて新規治療の有益な効果は日常的に基づいて臨床 GvHD によるスコア6。これらのスコアが反映するように適切な例えば、全体的な疾病負担 (すなわち、全身の GvHD) 臨床スコア不足臓器特異症状を確実にミラーへの感受性 (例,腸内で)。したがって、結論は、スコアリング システム通常これらに基づく特定の治療的介入の腸保護効果に関して、例えば短い落ちる。
新規全身の発明によって主要な進歩にもかかわらず画像診断法、発光や蛍光遺伝子マウス モデル7,8の使用法との組み合わせで直接、具体的は方法論腸内を評価する生きているマウスで GvHD の症状が欠けています。したがって、次のセクションで説明されている腸管 GvHD 表現型の内視鏡的評価のプロトコルの後ろの理論的根拠は、この障害を克服するためにです。さらに、モチベーションは以来、これまでのところ、細胞、形態学的、および分子特性の詳細な評価実験マウスの数を減らすにも (例えば,病理組織学的、分子生物学) 腸管 gvhd症状は、実験マウスの犠牲を最終的に必要があります。
当院は大腸の症状同系大腸炎モデル9間のミニ内視鏡的評価の方法論上以前報告しています。ここで提示されたプロトコル、洗練され、内視鏡を適応して私は完全に設定を一致しない alloresponse 駆動 alloreactive の移植時に腸管 GvHD と生きたマウス大腸炎 MHC クラスで HCT およびドナーのリンパ球のためのスコアリング マトリックス.腸管 GvHD 関連大腸病変を反映するように適した 4 つのパラメーターを同定しました。さらに、我々 は容易に腸管 GvHD 時点時点で与えられたマウスでの重症度について読者に知らせる新しいスコアの結果により、任意の 1 つの決定要因の微調整グレーディング システムを設立しました。病理組織学的分析は、特定のしきい値以上の内視鏡スコアは中程度の高級組織の炎症を予測して確実に確認しました。したがって、ミニ内視鏡的評価は、日常的に実験的マウスの犠牲を必要とする金本位制の病理組織学的に動作している代替を示す表示されます。重要なは、このプロトコルは、実質的に任意の特定の時点に適用できるし、病気10,11のコースの間に繰り返し使用できます。さらに、発光依存アプローチの使用と対照をなして交配遺伝子改変マウスのような激しい労働や時間がかかる対策も不要と、あらゆるマウスの線上の方法論を適用できるそれ故に、関心します。
まとめると、重症の消化管 GvHD 同種 HCT 患者の有害な臨床的視点を与えて急速な科学の進歩と免疫病態分子メカニズムに洞察力が急務します。同様に、重要な倫理的な考慮事項を要求する知識のゲインが実験的マウスの最小限の使用と達成されるべき。したがって、両方の実験的な作品チェーンを監視し、ライブの実験的マウス腸管 GvHD をグレードでコロンのシリアル ミニ内視鏡評価を実装して腸管 GvHD を探索研究コミュニティの要求を進めることができる認識モデルとして説明し、ここで提示されたプロトコルで検証。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルでは、誘導の方法論と腸管 GvHD 間観測された大腸の表現型のミニ内視鏡評価について説明します。科学者 (すなわちから大腸の症状と最大の疾患活動性までの進行の発症) 全体の病気にわたって縦方向と非侵襲的腸管 GvHD を調査するを有効にするのより広い目的を提供しています。
ただし、本質がありますいくつかの重要なステップと重要な制限事項提示の方?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、共同研究センター (CRC) 221 (CRC/TR221 (dfg)、#324392634; プロジェクト B03) (コンゴ) や CRC 1181 (CRC (dfg)、プロジェクト B05) (コンゴ) に支えられた、ドイツ研究振興協会 (DFG、ドイツ研究振興協会) によって資金を供給される両方。
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
Referências
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