Inducción de Intestinal injerto - versus - host Disease y su evaluación Mini-endoscópica en ratones vivos
Summary
Aquí, presentamos un protocolo que describe el trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y permite evaluaciones repetitivas mini-endoscópica del colon distal in situ para la presencia, características y severidad de inflamación colónica en vivo ratones de intestinal injerto – versus – host disease.
Abstract
Agudo injerto – versus – host disease (GvHD) representa la complicación más severa que los pacientes previamente sometidos a cara de (allo-HCT) del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas y se asocia frecuentemente con un resultado clínico pobre. Mientras que, por ejemplo, GvHD manifestaciones de la piel generalmente responden a terapias inmune supresora establecidas y, por lo tanto, no tienen un curso fatal, la presencia y la intensidad de la GvHD intestinal, especialmente de las partes de la mitad inferior del intestino, influir fuertemente en el resultado y en general la supervivencia de pacientes con agudo GvHD. opciones terapéuticas son esencialmente se limita a los clásicos agentes inmune supresora rendimiento sólo moderados efectos atenuantes de la enfermedad. Por lo tanto, un conocimiento detallado sobre la cascada inmune reside en el tejido, cambios en la microbiota intestinal y la respuesta estromal anterior, sobre y después de la aparición de EICH intestinal se necesitan urgentemente para entender los acontecimientos y los mecanismos que subyacen a su patogenesia y desarrollar opciones terapéuticas innovadoras. Modelos murinos de GvHD se emplean con frecuencia para identificar y evaluar funcionalmente las moléculas y vías de conducción supuestamente GvHD intestinal. Sin embargo, significa específicamente monitorear y evaluar inflamación intestinal con el tiempo esencialmente faltan desde puntuaciones establecidas para evaluar grado de EICH aguda habitualmente se componen de diversos parámetros que reflejan más bien sistémica GvHD manifestaciones. La evaluación detallada de GvHD intestinal ha sido restringida a estudios utilizando ratones eutanasia, exclusión de tal modo esencialmente longitudinal (es decir, cinética) análisis del compartimiento del colon bajo una determinada condición experimental (por ejemplo, anticuerpo-mediada bloqueo de una citocina proinflamatoria) en ratones vivos (es decir, en vivo). La evaluación in situ mini-endoscópica del colon distal de ratones tratados con HCT de allo que se describe aquí permite a) una evaluación macroscópica detallada de diferentes aspectos de la inflamación intestinal y b) la opción de recoger muestras de tejido para análisis posteriores en diferentes momentos a lo largo del período de observación. En general, el enfoque endoscópico mini proporciona un gran avance en evaluación de GvHD intestinal y monitoreo no invasivo preclínico.
Introduction
Malignidades hematopoyéticas derivadas directamente del compartimento de células madre hematopoyéticas y descontrolada, progresando rápidamente y graves desordenes inmune-mediados suelen ser indicaciones para HCT allo1,2. Sin embargo, aunque son responsables de la ocurrencia de la respuesta de injerto contra tumor beneficio pronóstica, los linfocitos del donante con frecuencia inducir y promover un ataque inmune-mediado no deseado de los componentes de tejido sano en el recipiente allo-HCT , un proceso que se llama injerto – versus – host disease3. En el intestino, el supuesto GvHD intestinal, las manifestaciones representan la complicación más temida de la GvHD aguda, formas graves de que son habitualmente asociadas con una alta mortalidad1,2,4.
General modelos murinos de allo-HCT han surgido como herramientas muy valiosas para identificar y estudiar mecanismos inmune-mediados subyacente a la patogenesia de GvHD5. Sin embargo, la evaluación cinética de, por ejemplo, efectos beneficiosos de las intervenciones terapéuticas novedosas con el tiempo en vivo ratones rutinariamente basa en la determinación de GvHD clínico puntuaciones6. Mientras que estos puntajes son convenientes reflejar, por ejemplo, la carga total de enfermedad (es decir, la GvHD sistémica), clínica puntuaciones falta la sensibilidad para reflejar confiablemente manifestaciones órgano específicas (por ejemplo,, en el intestino). Por lo tanto, conclusiones, por ejemplo con respecto a los efectos de gut-protección de una determinada intervención terapéutica, que se basan estos sistemas de puntuación generalmente se quedan cortas.
A pesar de los avances importantes a través de la invención de la novela todo el cuerpo la proyección de imagen modalidades en combinación con el uso de cualquier modelos de ratón genético bioluminiscente o fluorescente7,8, metodologías directamente y específicamente evaluar la intestinal carecen de manifestación de GvHD en ratones vivos. Por lo tanto, la razón de ser del Protocolo de la evaluación endoscópica de fenotipo GvHD intestinal que se describe en la sección siguiente es superar este obstáculo. Además, la motivación debe también reducir el número de ratones experimentales ya que, hasta ahora, una evaluación detallada de las características celulares, morfológicas y moleculares (e.g., por histopatología o biología molecular) de GvHD intestinal manifestación en última instancia ha requerido el sacrificio del ratón experimental.
Nuestra institución ha divulgado previamente en la metodología de la evaluación mini-endoscópica de colon manifestaciones en el curso de colitis syngeneic modelos9. En el protocolo que presentamos, hemos refinado y adaptado el colonoscopic puntuación matrix para la colitis alloresponse-conducido en vivo ratones con EICH intestinal sobre trasplante de alloreactive HCT y donante de linfocitos en un MHC de clase totalmente unida mal ajuste . Se identificaron cuatro parámetros adecuados para reflejar lesiones colónicas relacionadas con el EICH intestinales. Además, establecimos un sistema que permite una clasificación ajustada de cualquier factor individual, dando lugar a una nueva escala que fácilmente informa al lector acerca de la severidad de GvHD intestinal presente en un ratón dado en un momento dado. Los análisis histopatológicos confirmaron que una puntuación endoscópica por encima de cierto umbral es predecir confiablemente moderado a alto grado inflamación de los tejidos. Por lo tanto, la evaluación endoscópica mini parece representar un sustituto del trabajo de la histopatología de patrón oro que habitualmente requiere el sacrificio de los ratones experimentales. Importante, este protocolo puede ser aplicado en prácticamente cualquier punto de tiempo dado y puede ser utilizado repetidamente durante el curso de la enfermedad10,11. Además, en contraste con el uso de enfoques dependientes de bioluminiscencia, ninguna medida laboral intensa y laboriosa como entrecruzar genéticamente modificado ratones se requieren y, por lo tanto, la metodología puede ser aplicada en prácticamente cualquier línea de ratón de interés.
Tomados en conjunto, dado el punto de vista clínico perjudicial de pacientes allo-HCT con GvHD intestinal severo, rápido progreso científico y una visión más clara en los mecanismos moleculares subyacentes la patogenesia inmune están urgente. Asimismo, importantes consideraciones éticas exigen que el aumento de los conocimientos debe lograrse con el uso de la mínima cantidad de ratones experimentales. Por lo tanto, ambos reconocieron reclamaciones en la comunidad de investigación explorando GvHD intestinal se pueden avanzar mediante la aplicación de evaluaciones seriales mini-endoscópica del colon en la cadena de trabajo experimental para supervisar y GvHD intestinal en vivo ratón experimental del grado modelos, descrito y validado en el protocolo presentado aquí.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo describe la metodología de la inducción y evaluación mini-endoscópica del colon fenotipo observado en el curso de GvHD intestinal. Sirve el mayor propósito de permitir a los científicos estudiar GvHD intestinal longitudinalmente y de forma no invasiva en el transcurso de toda enfermedad (es decir, desde el inicio de la manifestación colónica y la progresión hasta la actividad máxima de la enfermedad).
Sin embargo, hay algunos pasos críticos y limitaciones importantes in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la colaboración investigación centros (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; proyecto B03) (a K.H.) y CRC 1181 (CRC-DFG, proyecto B05) (a K.H.), ambos financiados por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación alemana de investigación).
Materials
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Forceps (lenght: 13 cm; serrated, curved tips) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Hardened Fine Scissors (lenght: 8,5 cm; straight tips; cutting edge: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Hypodermic needle (26G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| 50 mL tube | Sarstedt Ag & Co.KG | 62,547,254 | |
| Cell strainer with a 40 µm mesh screen | BD Falcon | 352340 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingredient of ACK lysing buffer |
| Potassium bicarbonate (KHCO3) | Merck KGaA | 1,048,540,500 | ingredient of ACK lysing buffer |
| CD90.2 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | magnet cell separation to isolate T cell-depleted bone marrow cells |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | magnet cell separation to isolate splenic T cells |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.2 Antibody (clone: 104; lot: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lot: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-mouse CD4 Antibody (clone: GK1.5; lot: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD45.1 Antibody (clone: A20; lot: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-mouse CD8a Antibody (clone: 53-6.7, lot: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Filtrated bovine serum | Pan Biotec | P40-47500 | ingredient of FACS buffer |
| 96-well polystyrene V-bottom plates | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRFortessa II flow cytometer | BD Bioscience Co. | ||
| Insulin syringe with sterile interior (30G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Eickemeyer | oxygen concentrator for anesthesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | 213062 | |
| Plexiglass chamber | Eickemeyer | 214620 | |
| Straight Forward Telescope | KARL STORZ SE &Co KG | 64301 AA | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Protection and Examination Sheath | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 C | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Examination Sheath with working channel | KARL STORZ SE &Co KG | 61029 D | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Biopsy Forceps | KARL STORZ SE &Co KG | 61071 ZJ | part of the experimental setup for colonoscopy |
| 175 Watt SCB XenonLight Source | KARL STORZ SE &Co KG | 20132120 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Fiber Optic Light Cable | KARL STORZ SE &Co KG | 495 NL | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE &Co KG | 22220030 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Image 1 SCB Camera Control Unit | KARL STORZ SE &Co KG | 22200020 | part of the experimental setup for colonoscopy |
| LCD monitor | Olympus | OEV181H | part of the experimental setup for colonoscopy |
| Forane / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Formaldehyde solution 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5,0 mL Dispenser tip | Eppendorf AG | 30089456 |
Referências
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