Autoradiografie als een eenvoudige en krachtige methode voor visualisatie en karakterisering van farmacologische doelstellingen

Summary

De methode van autoradiografie is routinematig gebruikt om de binding van radioligands aan weefselsecties voor bepaling van de farmacologie van kwalitatieve of kwantitatieve studie.

Abstract

In vitro autoradiografie is gericht op het visualiseren van de anatomische distributie van een proteïne van belang in weefsel van proefdieren evenals mensen. De methode is gebaseerd op de specifieke binding van een radioligand naar haar biologische doel. Daarom, bevroren weefselsecties worden geïncubeerd met radioligand oplossing, en de binding aan de doelstelling vervolgens is gelokaliseerd door de detectie van radioactief verval, bijvoorbeeld met behulp van lichtgevoelige film of fosfor imaging platen. Resulterende digitale autoradiograms weer opmerkelijke ruimtelijke resolutie, waarmee de kwantificering en localisatie van radioligand binding in verschillende anatomische structuren. Bovendien voorziet kwantificering de farmacologische karakterisering van ligand affiniteit op door middel van dissociatieconstanten (K_d), remming-constanten zijn (K_ik), alsmede de dichtheid van bandplaatsen (B_max) in geselecteerde weefsels. De methode biedt dus informatie over zowel de doel lokalisatie en de selectiviteit van het ligand. Hier, wordt de techniek geïllustreerd met autoradiografie karakterisering van het zuur met hoge-affiniteit γ-hydroxybutyraat (GHB) bindend sites in zoogdieren hersenweefsel, met speciale nadruk op methodologische overwegingen met betrekking tot de bepaling van de bindende parameters, de keuze van de radioligand en de detectiemethode.

Introduction

Autoradiografie is een methode waarmee beelden van radioactief verval. De techniek is routinematig gebruikt om de studie van de verdeling van de weefsel van een proteïne van belang in vitro op basis van een specifieke farmacologische interactie tussen een radioactief gelabelde stof en haar doelstelling. Dit voorziet rechtstreekse informatie over de selectiviteit van het ligand in het doel. In vitro autoradiografie kan ook worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van farmacologische bindende parameters van radioligands, zoals de dissociatieconstante (K_d) en de dichtheid van bandplaatsen (B_max), alsmede voor het bepalen van de remming constante (K_i) van concurrerende liganden^1,2. Vergeleken met traditionele homogenaat radioligand binding, heeft autoradiografie het voordeel van kunnend visualiseren ruimtelijke anatomie en beknopte vermelding van regionale expressie patronen³. De methode van autoradiografie is daarom een relevante alternatief voor immunocytochemie, met name in het ontbreken van een gevalideerde antilichaam. Autoradiografie is eenvoudig toe te passen in een standaard isotoop laboratorium gegeven van de beschikbaarheid van een geschikte radioligand met de vereiste farmacologische specificiteit, toegang tot een microtoom cryostaat voor het voorbereiden van weefselsecties, en een geschikte beeldvorming apparaat welk vermag de verdeling van de radioactiviteit in de respectieve weefselsecties analyseren. Met name is een belangrijk selectiecriterium voor de radioligand een beperkte hoeveelheid binding aan doelsoort sites. Dit kan naar andere eiwitten, membranen of materialen zoals plastic of filters, en wordt gezamenlijk aangeduid als niet-specifieke binding. Meestal kan niet-specifieke binding is niet-verzadigbare maar verzadigbare als het gaat om een specifieke uit-target proteïne. De beste manier van valideren waar specifieke binding is te vergelijken met weefsels ontbreekt het doel, bijvoorbeeldgenetisch gemanipuleerde (knock-out) weefsel⁴.

De methodologie is hier, geïllustreerd met de autoradiografie karakterisering van de hoge-affiniteit bindende site voor zuur van γ-hydroxybutyraat (GHB) in de hersenen van zoogdieren. Inzicht in de farmacologische interactie tussen GHB en zijn bindende plaats is van belang als GHB zowel een klinisch nuttig drug in de behandeling van narcolepsie en alcoholisme⁵, maar ook een natuurlijk bestanddeel van de zoogdieren hersenen en een recreatieve is drug⁶. Hoge-affiniteit GHB bandplaatsen waren eerst beschreven met behulp van [³H] GHB binding aan de rat hersenen homogenaat⁷. Door de jaren heen, verder autoradiografie studies met [³H] GHB en de analoge [³H] NCS-382 heeft een hoge dichtheid van bindende sites in reukkolf gebieden van rat^8,9,10, muis⁹ , varken¹¹en aap/mens hersenen¹². De moleculaire identiteit en exacte functionele relevantie van deze bandplaatsen hebben bleef echter ongrijpbaar.

Met de bedoeling om te verder karakteriseren de bandplaatsen en te vergemakkelijken van studies over de fysiologische rol van GHB, meerdere radioligands integratie van verschillende isotopen begiftigd met verschillende affiniteiten zijn ontwikkeld ([³H] GHB, [³ H] NCS-382, [³H] HOCPCA en [¹²⁵ik] BnOPh-GHB)^13,14,15,16(herzien in¹⁷) (figuur 1). De combinatie van selectieve hoge-affiniteit radioligands inwoners en een bevolkingsdichtheid van de zeer hoge weefsel van de binding sites hebben toegestaan voor de productie van hoge-kwaliteit beelden met behulp van de fosfor imaging techniek^9,11. Samen met een overzicht van de praktische punten bij het opzetten van een autoradiografie experiment en een illustratie te illustreren details, zal de sectie discussie benadrukken i) de keuze van de radionuclide, ii) de keuze van assay voorwaarden, en iii) het gebruik van fosfor Imaging platen versus X-ray film. Het algemene doel van deze paper is te voorzien in technische, methodologische en wetenschappelijke bijzonderheden over de techniek van autoradiografie informeren over weefsel distributie en farmacologische analyse van eiwit doelen.

Protocol

Alle dier behandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtsnoeren van de Deense dier experimenten inspectie. Opmerking: Het protocol hier beschreven dekt weefsel voorbereiding (d.w.z., muis hersenweefsel), de in vitro autoradiografie assay in voldoende detail voor het opzetten van de methode in een nieuw lab, de blootstelling aan fosfor imaging platen, evenals Na diverse densitometric analyses van autoradiograms (Figuur 2) met als doel…

Representative Results

Met behulp van het protocol beschreven, was de anatomische distributie van de hoge-affiniteit GHB bandplaatsen gevisualiseerd met de hoeveelheid radioactief gemerkte GHB analoge [3H] HOCPCA in de hersenen van de muis, die werd gesneden in coronale, Sagittaal en horizontale secties (Figuur 3 ). Hoge niveaus van bindende werden waargenomen in de hippocampus en de cortex, lagere binding in het striatum en geen bindende werd ontdekt in het cerebellum, …

Discussion

De kwaliteit van een autoradiografie bepaling wordt meestal bepaald door de gevoeligheid van de radioligand. Een belangrijke factor is de geselecteerde isotoop, dat wordt gegeven door de beschikbaarheid van bekende liganden of het haalbaar is specifieke etikettering technieken aan opbrengst liganden met passende specifieke activiteit (dat wil zeggen, de hoeveelheid radioactiviteit per eenheid mol van een radioligand)²³en met een beperkte hoeveelheid chemische aantasting. Een groot aantal …

Materials

Absolute ethanol	Merck Millipore	107017
Acetic acid	Sigma-Aldrich	A6283
BAS-TR2040 Imaging Plate	GE Healthcare Life Science	28956481	20×40 cm – Sensitive to tritium
Cresyl violet acetate	Sigma-Aldrich	C5042-10G
DPX (non-aqueous mounting medium for microscopy)	Merck Millipore	100579
O.C.T. Compound, 12 x 125 mL	Sakura	4583	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R
Superfrost Plus slides	VWR	631-9483	microscope slides
Tissue-Tek Manual Slide Staining Set	Sakura Finetek Denmark ApS	4451
Tritium Standard on Glas	American Radiolabeld Chemicals, Inc.	ART 0123
Xylene substitute	Sigma-Aldrich	A5597