Escherichia coli-cel-Free eiwitsynthese gebaseerd: protocollen voor een robuuste, flexibele en toegankelijk platformtechnologie

Summary

Dit protocol detailleert de stappen, kosten, en apparatuur die nodig is voor het genereren van E. coli-op basis van cel extracten en uit te voeren in vitro eiwit synthese reacties binnen 4 dagen of minder. Om de invloed van de flexibele aard van dit platform voor brede toepassingen, bespreken we reactie voorwaarden die kunnen worden aangepast en geoptimaliseerd.

Abstract

In de afgelopen 50 jaar, heeft cel-vrij proteïne synthese (GVB) ontpopt als een krachtige technologie om uit te rusten van de transcriptionele en translationele capaciteit van cellen in een reageerbuis. Door het wegnemen van de noodzaak om de levensvatbaarheid van de cel, en door het wegnemen van de cellulaire barrière, is GVB fundamenteel aan opkomende toepassingen in de biomanufacturing van oudsher uitdagende eiwitten, evenals toepassingen, in snelle prototyping voor Metabole engineering en functionele genomica. Onze methoden voor de uitvoering van een e-coli-gebaseerde GVB platform dat nieuwe gebruikers toegang tot veel van deze toepassingen. We beschrijven hier, methoden om te bereiden extract door middel van verrijkte media, verbijsterd kolven en een reproduceerbare methode van afstembare ultrasoonapparaat gebaseerde cellysis. Dit extract kan vervolgens worden gebruikt voor eiwit expressie geschikt voor het produceren van 900 µg/mL of meer van de super map groen fluorescent proteïne (sfGFP) in enkel 5 h van experimentele opstelling van data-analyse, gezien het feit dat geschikt reagens voorraden zijn vooraf opgesteld. De kosten van de geschatte opstarten voor het verkrijgen van reagentia is $4,500 die duizenden reacties op een geraamde kostprijs van $0.021 per µg eiwit geproduceerd of $0.019 per µL van reactie zal ondersteunen. De eiwit expressie methoden spiegel daarnaast het gemak van de setup van de reactie in de verkrijgbare systemen als gevolg van optimalisatie van reagens voormengsels, tegen een fractie van de kosten gezien. Zodat de gebruiker om de invloed van de flexibele aard van het GVB platform voor brede toepassingen, hebben we geconstateerd dat een aantal aspecten van het platform dat kan worden afgestemd en geoptimaliseerd afhankelijk van de beschikbare middelen en de eiwit expressie resultaten gewenste.

Introduction

Cel-vrij proteïne synthese (GVB) heeft ontpopt als een technologie die heeft een aantal nieuwe mogelijkheden voor de productie van eiwitten, functionele genomica, Metabole engineering en meer in de laatste 50 jaar^1,2ontgrendeld. In vergelijking met standaard in vivo eiwit expressie platformen, GVB biedt drie belangrijke voordelen: 1) de cel-vrije aard van het platform mogelijk maakt de productie van eiwitten dat zou potentieel giftige of vreemd aan de cel^{3,4 ,5,6}; 2) inactivatie van genomic DNA en de invoering van een sjabloon DNA codering van de gene(s) van belang kanaal alle systemische energie binnen de reactie op de productie van de expressie gebrachte eiwitten van belang; en 3) het open karakter van het platform kan de gebruiker wijzigen en controleren van de omstandigheden en de samenstelling in real-time^7,8. Deze directe toegang tot de reactie ondersteunt de vergroting van biologische systemen met uitgebreide oplossingen en redox voorwaarden voor de productie van nieuwe eiwitten en de afstemming van metabole processen^{2,9, 10}. directe toegang maakt het ook mogelijk de gebruiker aan het combineren van de GVB-reactie met activiteit testen in een één-pot-systeem voor een snellere design-build-test cycli¹¹. De capaciteit om te voeren van de GVB-reactie in klein volume druppels of op papier gebaseerde apparaten verder ondersteunt high-throughput ontdekking inspanningen en snelle prototyping^{12,13,14,15 ,16}. Als gevolg van deze voordelen en de plug en play-aard van het systeem, GVB uniek heeft een scala aan biotechnologische toepassingen zoals de productie van eiwitten die moeilijk te solubly snel in vivo^{17, 18,19,20}, opsporing van ziekte^21,22,23, op vraag biomanufacturing^{18,24 ,25,26,27}, en onderwijs^28,29, die allemaal Toon de flexibiliteit en bruikbaarheid van de cel-vrije platform.

GVB systemen kunnen worden gegenereerd uit een verscheidenheid van ruwe lysates van beide cellijnen prokaryote en eukaryote. Dit zorgt voor diverse opties in het systeem van keuze, die elk voor- en nadelen, afhankelijk van de toepassing van belang zijn. GVB systemen ook variëren sterk in voorbereidingstijd, kosten en productiviteit. De meeste vaak gebruikt cel extracten worden geproduceerd van tarwekiemen, konijn Retikulocyt, insect cellen en Escherichia coli cellen, met de laatste is de meest kosteneffectieve tot nu toe terwijl de productie van de hoogste volumetrische opbrengst van eiwit³⁰ . Terwijl andere systemen GVB kunnen nuttig zijn voor hun aangeboren posttranslationele wijziging-machinery, opkomende toepassingen met behulp van de E. coli-gebaseerde machines zijn in staat de kloof te overbruggen door het genereren van site-specifically gefosforyleerd en geglycosyleerde eiwitten op vraag^{31,32,33,34,35}.

GVB reacties kunnen worden uitgevoerd in een batch, continu-uitwisseling cel-vrij (CECF) of continue-stroom cel-vrij (CFCF) formaten. De batch-indeling is een gesloten systeem waarvan reactie levensduur beperkt als gevolg van de afnemende hoeveelheid reactanten en de accumulatie van remmende bijproduct van de reactie is. CECF en CFCF methoden verhogen de levensduur van de reactie, en daardoor leiden tot verhoogde volumetrische eiwit rendementen ten opzichte van de batch-reactie. Dit wordt bereikt doordat de bijproducten van de eiwitsynthese te worden verwijderd uit het reactievat, terwijl nieuwe reactanten worden geleverd in de loop van de reactie². In het geval van CFCF, kan de proteïne van belang ook worden verwijderd uit de zaal reactie, terwijl in de CECF, de proteïne van belang blijft in de zaal van de reactie van een semi-permeabel membraan^36,37samengesteld. Deze methoden zijn vooral waardevol zijn bij het overwinnen van arme volumetrische opbrengst van moeilijk-aan-express proteïnen van belang^{38,39,40,41,42, 43}. De uitdagingen bij de uitvoering van de CECF en CFCF benaderingen zijn dat 1) terwijl ze leiden een efficiënter gebruik van de bio-machine verantwoordelijk voor transcriptie en vertaling tot, zij vereisen met name grotere hoeveelheden van reagentia die een toename van de totale kosten en 2) ze vereisen meer complexe reactie opstellingen en gespecialiseerde apparatuur ten opzichte van de batch formaat⁴⁴. Met het oog op toegankelijkheid voor nieuwe gebruikers, beschreven de protocollen hierin focus op het formaat van de partij bij reactie volumes van 15 µL met specifieke aanbevelingen voor het verhogen van het volume van de reactie op de schaal van de milliliter.

De hier vermelde methoden niet-deskundigen met basic Labor vaardigheden (zoals studenten) inschakelen voor de uitvoering van de celgroei, uitpakken van de voorbereiding en batch formaat reactie setup voor een e-coli-gebaseerde systeem van het GVB. Deze aanpak is rendabel commercieel beschikbare kits t.o.v. zonder in te boeten op het gemak van kit gebaseerde reactie setup. Deze aanpak maakt bovendien toepassingen in het laboratorium en in het veld. Bij de beslissing om de implementatie van GVB, moeten nieuwe gebruikers grondig evalueren de werkzaamheid van conventionele eiwit expressiesystemen voor opstarten investeringen, zoals GVB niet kan superieur in ieder geval. De hier beschreven methoden voor het GVB zodat de gebruiker direct om een verscheidenheid van toepassingen, met inbegrip van functionele genomica, high-throughput testen, de productie van eiwitten die hardnekkige voor in vivo expressie, evenals veld zijn toepassingen met inbegrip van biosensoren en educatieve kits voor synthetische biologie. Extra toepassingen zoals Metabole engineering, afstemming van eiwit expressie voorwaarden, opsporing van de ziekte, en schaal-up met behulp van CECF of CFCF methoden zijn nog steeds mogelijk, maar wellicht ervaring met het GVB-platform voor de verdere wijziging van de reactie voorwaarden. Onze methoden combineren groei in de verrijkte media en verbijsterd kolven, met relatief snelle en reproduceerbare methoden van lysis van de cel via ultrasoonapparaat, gevolgd door een vereenvoudigde GVB reactie setup dat gebruik maakt van geoptimaliseerde premixen⁴⁵. Terwijl de cellulaire groei methoden hebben enigszins worden gestandaardiseerd op dit gebied, lopen methoden voor lysis van de cel sterk uiteen. Naast ultrasoonapparaat omvatten gemeenschappelijke lysis methodes gebruik van een Franse pers, een homogenizer, kraal drijvers, of lysozym en andere verstoring van de biochemische en fysische methoden^{46,47,48, 49}. met behulp van onze methoden ongeveer 2 mL van ruwe cel extract worden verkregen per 1 liter van cellen. Deze hoeveelheid cel extract kan steunen vier honderd 15 µL GVB reacties, elke producerende ~ 900 µg/mL verslaggever sfGFP eiwit uit de sjabloon plasmide pJL1-sfGFP. Deze methode kost $0.021/µg sfGFP geproduceerd ($.019/µL van reactie), exclusief de kosten van arbeid en uitrusting (aanvullende figuur 1). Vanaf de nul, deze methode toegepast kunnen worden in 4 dagen door een enkele persoon en herhaal GVB reacties kunnen worden voltooid binnen uur (Figuur 1). Bovendien kan het protocol worden opgeschaald in volume voor grotere partijen reagens voorbereiding aan de behoeften van de gebruiker. Nog belangrijker is, kan het protocol gepresenteerd hier toegepast worden door laboratorium opgeleid niet-deskundigen zoals Voorgraadse studente, zoals zij alleen basic Labor vaardigheden vereist. De hieronder beschreven procedures, en de begeleidende video zijn specifiek ontwikkeld ter verbetering van de toegankelijkheid van de E. coli GVB platform voor breed gebruik.

Protocol

1. Media voorbereiding en celgroei Dag 1 Streak E. coli BL21*(DE3) cellen uit een glycerol voorraad op een bord van de agar LB en incubeer gedurende ten minste 18 uur bij 37 ° C. 50 mL van LB-media en autoclaaf de oplossing voor te bereiden op een vloeibare cyclus gedurende 30 minuten bij 121 ° C. Bewaren bij kamertemperatuur. Dag 2 750 mL 2 x YTP media en 250 mL 0,4 M D-Glucose-oplossing te bereiden zoals besch…

Representative Results

Wij hebben voorgesteld een ultrasoonapparaat gebaseerde E. coli extract voorbereiding protocol die met cijfer 1 demonstreren de procedurele verdeling over elke dag gedurende een vier-daagse span, kan worden voltooid. Er is buigbaarheid naar de stappen die in elke dag met diverse onderbreken punten kan worden voltooid, maar we hebben gevonden deze werkstroom het meest effectief uit te voeren. Bovendien zijn zowel de cel pellets (stap 1.3.18) en volled…

Discussion

Cel-vrije eiwitsynthese heeft ontpopt als een krachtige en activerende technologie voor een verscheidenheid van toepassingen variërend van biomanufacturing tot rapid prototyping van biochemische systemen. De breedte van de toepassingen wordt ondersteund door de capaciteit te controleren, manipuleren, en vergroten van cellulaire machines in real-time. Ondanks de groeiende impact van deze platformtechnologie, brede aanpassing gebleven traag als gevolg van technische nuances bij de uitvoering van de methoden. Door middel v…

Materials

Luria Broth	ThermoFisher	12795027
Tryptone	Fisher Bioreagents	73049-73-7
Yeast Extract	Fisher Bioreagents	1/2/8013
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P9791-500G
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270-1KG
KOH	Sigma-Aldrich	P5958-500G
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Mg(OAc)2	Sigma-Aldrich	M5661-250G
K(OAc)	Sigma-Aldrich	P1190-1KG
Tris(OAc)	Sigma-Aldrich	T6066-500G
DTT	ThermoFisher	15508013
tRNA	Sigma-Aldrich	10109541001
Folinic Acid	Sigma-Aldrich	F7878-100MG
NTPs	ThermoFisher	R0481
Oxalic Acid	Sigma-Aldrich	P0963-100G
NAD	Sigma-Aldrich	N8535-15VL
CoA	Sigma-Aldrich	C3144-25MG
PEP	Sigma-Aldrich	860077-250MG
K(Glu)	Sigma-Aldrich	G1501-500G
NH4(Glu)	MP Biomedicals	02180595.1
Mg(Glu)2	Sigma-Aldrich	49605-250G
Spermidine	Sigma-Aldrich	S0266-5G
Putrescine	Sigma-Aldrich	D13208-25G
HEPES	ThermoFisher	11344041
Molecular Grade Water	Sigma-Aldrich	7732-18-5
L-Aspartic Acid	Sigma-Aldrich	A7219-100G
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500-25G
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254-25G
L-Phenylalanine	Sigma-Aldrich	P2126-100G
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752-25G
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000-25G
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7352-25G
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625-25G
L-Alanine	Sigma-Aldrich	A7627-100G
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A8094-25G
L-Asparagine	Sigma-Aldrich	A0884-25G
Glycine	Sigma-Aldrich	G7126-100G
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126-250G
L-Histadine	Sigma-Aldrich	H8000-25G
L-Lysine	Sigma-Aldrich	L5501-25G
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380-100G
L-Serine	Sigma-Aldrich	S4500-100G
L-Threonine	Sigma-Aldrich	T8625-25G
L-Tyrosine	Sigma-Aldrich	T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL	Fisher Scientific	05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL	Fisher Scientific	05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL	Fisher Scientific	05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit	ThermoFisher	K210007
Ultrasonic Processor	QSonica	Q125-230V/50Hz	3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge	Beckman Coulter	369001
JLA-8.1000 Rotor	Beckman Coulter	366754
1L Centrifuge Tube	Beckman Coulter	A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask	Sigma-Aldrich	Z710822
Microfuge 20	Beckman Coulter	B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator	Eppendorf	M1335-0000
Cytation 5	BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit	IBA	2-4998-000
pJL1-sfGFP	Addgene	69496
BL21(DE3)	New England BioLabs