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Química

Escherichia coli-base de la synthèse protéique acellulaire : protocoles pour une technologie de plate-forme robuste, flexible et accessible

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Ce protocole détaille les étapes, les coûts et équipements nécessaires pour générer des e. coli-extraits cellulaires de base et mettre en œuvre en vitro réactions de synthèse de protéines dans les 4 jours ou moins. Pour tirer parti de la souplesse de cette plate-forme pour les applications larges, nous discutons des conditions de réaction qui peuvent être adaptées et optimisées.

Abstract

Au cours des 50 dernières années, la synthèse de protéine acellulaire (CFPS) est devenue une technologie puissante pour exploiter la capacité transcriptionnelle et translationnelle des cellules dans un tube à essai. En évitant la nécessité de maintenir la viabilité de la cellule et en éliminant la barrière cellulaire, PFC a été fondamentale aux applications émergentes en biofabrication de protéines traditionnellement difficiles, ainsi que des applications de prototypage rapide pour génie métabolique et la génomique fonctionnelle. Nos méthodes de mise en œuvre d’un e. coli-plateforme PFC permettre à nouveau aux utilisateurs d’accéder à bon nombre de ces applications. Nous décrivons ici les méthodes pour préparer l’extrait par l’utilisation de milieux enrichis, flacons déroutés et une méthode reproductible de la lyse cellulaire de base sonication accordable. Cet extrait peut ensuite servir pour l’expression de la protéine capable de produire 900 µg/mL ou plus de la protéine fluorescente de super dossier vert (sfGFP) dans seulement 5 h de montage expérimental à l’analyse des données, étant donné que les stocks de réactifs appropriés ont été préparés préalablement. Le coût estimatif de démarrage d’obtenir des réactifs est $ 4 500 qui soutiendront des milliers de réactions à un coût estimatif de 0,021 $ par µg de protéines produites ou 0,019 $ par µL de réaction. En outre, les méthodes d’expression de protéine en miroir la facilité de l’installation de réaction vue dans les systèmes disponibles dans le commerce grâce à l’optimisation des mélanges réactifs, à une fraction du coût. Afin de permettre à l’utilisateur de tirer parti de la souplesse de la plate-forme de produits forestiers certifiés pour des applications larges, nous avons identifié les divers aspects de la plate-forme qui peut être à l’écoute et optimisé selon les ressources disponibles et des résultats d’expression de protéine vous le souhaitez.

Introduction

Synthèse de protéine acellulaire (CFPS) a émergé comme une technologie qui a débloqué un certain nombre de nouvelles opportunités pour la production de protéines, génomique fonctionnelle, génie métabolique et plus encore dans les derniers 50 ans1,2. Par rapport à la norme en vivo plates-formes expression de protéine, CFPS offre trois avantages principaux : 1) la nature acellulaire de la plate-forme permet la production de protéines qui seraient potentiellement toxiques ou étrangers à la cellule3,4 ,5,6; 2) inactivation de l’ADN génomique et la mise en place d’un modèle d’ADN codant le gène d’intérêt canaliser toute l’énergie systémique au sein de la réaction à la production des ou des protéines d’intérêt ; et 3) la nature ouverte de la plate-forme permet à l’utilisateur de modifier et de surveiller les conditions de la réaction et la composition en temps réel7,8. Cet accès direct à la réaction prend en charge l’augmentation des systèmes biologiques avec des chimies élargis et conditions redox pour la production de nouvelles protéines et l’accordage des processus métaboliques2,9, 10. direct access permet également l’utilisateur de combiner la réaction de PFC avec tests d’activité dans un système single-pot des cycles de conception-construction-test plus rapide11. La capacité à effectuer la réaction de PFC dans les gouttelettes de faible volume ou sur appareils sur papier plus soutient les efforts de découverte de haut débit et de prototypage rapide12,13,14,15 ,,16. À la suite de ces avantages et de la nature de plug-and-play du système, CFPS unique a permis à une variété d’applications de biotechnologie telles que la production de protéines qui sont difficilement soluble express en vivo17, 18,19,20, détection des maladies21,22,23, sur demande la biofabrication18,24 ,25,26,27et l’éducation28,29, qui montrent la flexibilité et l’utilité de la plate-forme acellulaire.

Systèmes de PFC peuvent provenir d’une variété de lysats bruts de deux lignées de cellules procaryotes et eucaryotes. Cela permet diverses options dans le système de choix, chacun d’entre eux ont des avantages et inconvénients selon l’application des intérêts. Systèmes de CFPS varient également considérablement en productivité, coût et temps de préparation. Le plus couramment utilisé cellule extraits sont produites à partir de germe de blé, réticulocytes de lapin, des cellules d’insecte et cellules d’Escherichia coli , cette dernière étant la plus efficace à ce jour tout en produisant le meilleur rendement volumétrique de la protéine30 . Alors que les autres systèmes de PFC peuvent être avantageux pour leurs machines de modification post-traductionnelle innée, nouvelles applications à l’aide de l’ e. coli-machines basé sont en mesure de combler le fossé en générant relativement phosphorylée et protéines glycosylées sur demande31,32,33,34,35.

Réactions de PFC peuvent être exécutées dans chaque lot, échange continu acellulaire (CECF) ou acellulaire (CFCF) formats de flux continu. Le format de lot est un système fermé, dont vie de réaction est limitée en raison de la diminution des quantités de réactifs et l’accumulation des sous-produits inhibiteurs de la réaction. Méthodes CECF et CFCF augmentent la durée de vie de la réaction et ainsi entraînent des rendements de protéine volumétrique accrue par rapport à la réaction de lot. Ceci est accompli en autorisant les sous-produits de la synthèse protéique à être retiré de la cuve de réaction alors que nouveaux réactifs sont fournis tout au long de la réaction2. Dans le cas de la CFCF, la protéine d’intérêt peut également être retirée de la chambre de réaction, tandis que dans la CECF, la protéine d’intérêt demeure dans la chambre de réaction, composé d’une membrane semi-perméable36,37. Ces méthodes sont particulièrement utiles pour surmonter les piètres rendements volumétriques de difficile-à-express des protéines d’intérêt38,39,40,41,42, 43. Les difficultés à mettre en œuvre les approches CECF et CFCF sont que 1) alors qu’ils se traduire par une utilisation plus efficace des machines bio responsable de la transcription et la traduction, ils exigent notamment de plus grandes quantités de réactifs, ce qui augmente le coût global et 2) ils nécessitent des configurations plus complexes de réaction et d’équipements spécialisés par rapport à la lot format44. Afin d’assurer l’accessibilité pour les nouveaux utilisateurs, les protocoles décrits se concentrer sur le format de traitement par lots à des volumes de réaction de 15 µL avec des recommandations précises pour augmenter le volume de réaction à l’échelle de millilitre.

Les méthodes présentées ici permettent profanes avec des compétences de laboratoire de base (telles que les étudiants de premier cycle) à mettre en œuvre la croissance cellulaire, extrait préparation et format réaction configuration de lot pour un e. coli-système de PFC. Cette approche est rentable par rapport aux kits disponibles dans le commerce sans sacrifier la facilité d’installation basé sur kit de réaction. En outre, cette approche permet aux applications en laboratoire et sur le terrain. Lorsque vous décidez de mettre en œuvre des produits forestiers certifiés, nouveaux utilisateurs devraient évaluer soigneusement l’efficacité des systèmes d’expression de protéine conventionnelle pour l’investissement de démarrage, comme le PFC n’est peut-être pas supérieure dans tous les cas. Les méthodes CFPS décrites ici permettent à l’utilisateur d’appliquer directement une variété d’applications, y compris la génomique fonctionnelle, haut débit stable, la production de protéines qui sont insolubles pour in vivo de l’expression, mais aussi de champ applications, y compris les biocapteurs et trousses pédagogiques pour la biologie synthétique. Des applications supplémentaires, tels que l’ingénierie métabolique, tuning des conditions d’expression de protéine, détection de la maladie et mesurent-vers le haut à l’aide des méthodes CECF ou CFCF sont toujours possibles mais peuvent exiger l’expérience avec la plateforme PFC pour une modification supplémentaire de la réaction conditions. Nos méthodes de conjuguer croissance en milieux enrichis et flacons déroutés, et des méthodes relativement rapides et reproductibles de la lyse cellulaire par le biais de la sonication, suivie d’une configuration de réaction CFPS simplifiée qui utilise des prémélanges optimisé45. Même si les méthodes de croissance cellulaire ont devenu quelque peu normalisées dans ce domaine, procédés de lyse cellulaire varient considérablement. En plus de la sonication, les méthodes de lyse courantes sont utilisation d’une presse Français, un homogénéisateur, batteurs de perle, ou lysozyme et autres perturbations biochimiques et physiques méthodes46,47,48, 49. à l’aide de nos méthodes, environ 2 mL d’extrait cellulaire brut sont obtenus par 1 L de cellules. Cette quantité d’extrait cellulaire peut prendre en charge quatre cents réactions de CFPS 15 µL, chaque producteur ~ 900 µg/mL de protéine sfGFP journaliste du plasmide de modèle pJL1-sfGFP. Cette méthode coûte $ 0,021/µg de sfGFP produit ($.019/µL de réaction), à l’exclusion du coût du travail et des équipements (la Figure 1). À partir de l’éraflure, cette méthode peut être implémentée en 4 jours par une seule personne et répétez les réactions PFC peuvent être complétées en heures (Figure 1). En outre, le protocole peut être transposé en volume pour les plus gros lots de préparation du réactif aux besoins de l’utilisateur. Ce qui est important, le protocole présenté ici peut être implémenté par laboratoire formé profanes tels que les étudiants de premier cycle, comme elle exige seulement des compétences du laboratoire de base. Les procédures décrites ci-dessous et la vidéo qui l’accompagne ont été spécifiquement développés pour améliorer l’accessibilité de la plate-forme de PFC d’e. coli pour une utilisation large.

Protocol

1. médias préparation et croissance cellulaire Jour 1 Cellules d’Escherichia coli BL21*(DE3) Streak d’un glycérol stock sur une gélose LB et incuber pendant au moins 18 h à 37 ° C. Préparer 50 mL de médias LB et stériliser la solution sur un cycle de liquid pendant 30 minutes à 121 ° C. Conserver à température ambiante. Jour 2 Préparer 750 mL de 2 x YTP médias et 250 mL de 0,4 M de D-Glucose sol…

Representative Results

Nous avons présenté une sonication basée sur e. coli extrait protocole de préparation qui peut être effectué sur une période de quatre jours, avec la Figure 1 montrant la ventilation procédurale au cours de chaque journée. Il n’y a malléabilité aux étapes qui peut être accomplie chaque jour avec différents points de suspension, mais nous avons trouvé ce flux de travail la plus efficace d’exécuter. En outre, les granules cellulaire…

Discussion

La synthèse protéique acellulaire est devenue une technologie puissante et propice pour une variété d’applications allant de la biofabrication de prototypage rapide de systèmes biochimiques. L’ampleur des demandes est pris en charge par la capacité à contrôler, manipuler et d’augmenter la machinerie cellulaire en temps réel. En dépit de l’impact grandissant de cette technologie de plate-forme, adaptation large est restée lente en raison des nuances techniques dans la mise en œuvre des méthodes. Grâc…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Auteurs tient à remercier Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher et Tony Turretto pour le support technique, Wesley Kao, Layne Williams et Christopher Hight pour discussions utiles. Auteurs reconnaissent également de financement du projet de loi et Linda Frost fonds, centre pour les Applications de la biotechnologie Chevron biotechnologie appliquée recherche subvention de dotation, Cal Poly recherche, savantes, et programme de subvention des activités créatives (RSCA 2017), et la National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconnaît les subventions supérieures de l’Université California état. MCJ reconnaît l’Army Research Office W911NF-16-1-0372, National Science Foundation accorde MCB-1413563 et MCB-1716766, l’armée de l’Air recherche laboratoire centre d’Excellence Grant FA8650-15-2-5518, la subvention de l’agence défense menace la réduction HDTRA1-15-10052/P00001, la David and Lucile Packard Foundation, le programme d’enseignant-chercheur de Camille Dreyfus, le ministère de l’énergie BER Grant DE-SC0018249, le programme de sciences humaines de frontières (RGP0015/2017), la subvention ETOP DOE Joint Genome Institute, et le Consortium biomédicale de Chicago avec prise en charge par les fonds de Searle à la Chicago Community Trust pour la prise en charge.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
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Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
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