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Química

Escherichia coli-baseado sem célula de síntese de proteínas: protocolos para uma tecnologia de plataforma robusta, flexível e acessível

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Este protocolo detalha as etapas, custos e equipamentos necessários para gerar Escherichia coli-com base em extratos de células e implementar em vitro reações de síntese de proteínas dentro de 4 dias ou menos. Para aproveitar a natureza flexível desta plataforma para aplicações de amplas, podemos discutir as condições de reação que podem ser adaptadas e otimizadas.

Abstract

Nos últimos 50 anos, a síntese de proteína sem célula (CFPS) emergiu como uma poderosa tecnologia para aproveitar a capacidade transcricional e translacional de células dentro de um tubo de ensaio. Por obviating a necessidade de manter a viabilidade da célula e eliminando a barreira celular, CFPS tem sido fundamental para aplicações emergentes em biomanufacturing de proteínas tradicionalmente desafiadores, bem como aplicações em prototipagem rápida para engenharia metabólica e genômica funcional. Nossos métodos para implementar um Escherichia coli-baseado em plataforma CFPS permitir que novos usuários acessar muitos desses aplicativos. Aqui, descrevemos os métodos para preparar o extrato com o uso de meios enriquecidos, frascos perplexos e um método reprodutível de lise celular baseado em sonication ajustáveis. Este extrato pode ser usado na expressão de proteínas capaz de produzir 900 µ g/mL ou mais de proteína fluorescente verde super pasta (sfGFP) em apenas 5 h de instalação experimental para análise de dados, dado que os estoques de reagentes apropriados foram preparados antecipadamente. O custo estimado de inicialização de obtenção de reagentes é $4.500 que sustentarão milhares de reações em um custo estimado de US $0,021 por µ g de proteína produzida ou $0,019 por µ l de reação. Além disso, os métodos de expressão de proteínas espelham a facilidade da instalação do reação vista em sistemas comercialmente disponíveis devido à otimização de misturas prévias de reagente, em uma fração do custo. A fim de habilitar o usuário alavancar a natureza flexível da plataforma para aplicações de amplas CFPS, nós identificamos uma variedade de aspectos da plataforma que pode ser ajustado e otimizado dependendo dos recursos disponíveis e os resultados da expressão da proteína desejado.

Introduction

Síntese de proteína sem célula (CFPS) surgiu como uma tecnologia que desbloqueou uma série de novas oportunidades para a produção de proteína, genómica funcional, engenharia metabólica e muito mais no âmbito do último 50 anos1,2. Comparado ao padrão na vivo plataformas de expressão de proteínas, CFPS fornece três vantagens principais: 1) a natureza sem célula da plataforma permite a produção de proteínas que seriam potencialmente tóxicos ou estrangeiros para a célula3,4 ,5,6; 2) inativação do DNA genômico e a introdução de um modelo de DNA os genes de interesse de codificação canalizar toda a energia sistêmica dentro da reação para a produção das somáticas de interesse; e 3) a natureza aberta da plataforma permite ao usuário modificar e monitorar as condições da reação e a composição em tempo real7,8. Esse acesso direto para a reação suporta o aumento dos sistemas biológicos com químicos expandidos e redox as condições para a produção de novas proteínas e a otimização de processos metabólicos2,9, 10. direto acesso também permite ao usuário combinar a reação CFPS com ensaios de atividade em um sistema de single-pote para teste de compilação de projeto mais rápido ciclos de11. A capacidade de realizar a reação de CFPS em gotas de pequeno volume ou em dispositivos baseados em papel mais suporta os esforços de descoberta do elevado-throughput e prototipagem rápida12,13,14,15 ,16. Como resultado destas vantagens e da natureza de plug and play do sistema, CFPS excepcionalmente permitiu uma variedade de aplicações da biotecnologia tais como a produção de proteínas que são difíceis de solubly expresso na vivo17, 18,19,20, detecção de22,doença21,23, na demanda biomanufacturing18,24 ,25,26,27e educação28,29, os quais mostram a flexibilidade e a utilidade da plataforma livre de célula.

Sistemas CFPS podem ser gerados a partir de uma variedade de bruto lysates de ambas as linhas de células procariotas e eucariotas. Isto permite diversas opções no sistema de escolha, cada uma delas tem vantagens e desvantagens, dependendo da aplicação de juros. Sistemas CFPS também variam muito em produtividade, custo e tempo de preparação. Os mais comumente utilizaram célula extratos são produzidos a partir de células de Escherichia coli , sendo o último mais cost-effective para data ao produzir no mais alto rendimento volumétrico da proteína30, Reticulócito coelho, células de inseto e germe de trigo . Enquanto outros sistemas CFPS podem ser vantajosos para suas máquinas de modificação pós-traducional inata, emergentes aplicações usando o Escherichia coli-baseado em máquinas são capazes de preencher a lacuna, gerando site-specifically fosforilada e glicosilados proteínas na demanda31,32,33,34,35.

Reações de CFPS podem ser executadas em qualquer lote, troca contínua sem célula (CECF) ou fluxo contínuo sem célula (CFCF) formatos. O formato do lote é um sistema fechado, cujo tempo de vida de reação é limitado devido à diminuição de quantidades de reagentes e o acúmulo de subprodutos inibitórios da reação. CECF CFCF métodos aumentam o tempo de vida da reação e, assim, resultam em aumento volumétrico proteína rendimentos em comparação com a reação do lote. Isso é realizado, permitindo que os subprodutos da síntese de proteínas deve ser retirado da embarcação da reação, enquanto novos reagentes são fornecidos durante todo o curso da reação2. No caso de CFCF, a proteína de interesse também pode ser removida da câmara de reação, enquanto no CECF, a proteína de interesse permanece na câmara de reação, composto de uma membrana semi-permeável36,37. Esses métodos são especialmente valiosos na superação pobre rendimento volumétrico de difícil-para-expressam proteínas de interesse38,39,40,41,42, 43. Os desafios na implementação das abordagens CECF e CFCF são que 1) enquanto eles resultam em um uso mais eficiente da maquinaria bio responsável pela transcrição e tradução, necessitam de ser notavelmente maiores quantidades de reagentes que aumenta o custo geral e 2) Eles exigem mais complexa reação de configurações e equipamentos especializados em comparação com o formato de lote44. Para assegurar a acessibilidade para usuários novos, os protocolos descritos foco sobre o formato do lote em volumes de reação de 15 µ l com recomendações específicas para aumentar o volume de reação para a escala de mililitro.

Os métodos aqui apresentados permitem que não-especialistas com habilidades básicas de laboratório (tais como estudantes de graduação) para implementar o crescimento celular, extrair a preparação e instalação de reação de formato de lote para uma Escherichia coli-CFPS sistema baseado. Esta abordagem é rentável em comparação aos kits comercialmente disponíveis sem sacrificar a facilidade de instalação baseado no kit de reação. Além disso, essa abordagem permite que os aplicativos no laboratório e no campo. Ao decidir implementar CFPS, novos usuários devem avaliar cuidadosamente a eficácia dos sistemas de expressão da proteína convencional para investimento de inicialização, como CFPS não pode ser superior em todos os casos. Os métodos CFPS descritos aqui permitem ao usuário diretamente implementar uma variedade de aplicações, incluindo genômica funcional, alta produtividade, a produção de proteínas que são intratáveis por expressão em vivo , bem como campo de teste aplicações, incluindo biosensores e kits educativos para biologia sintética. Aplicações adicionais, tais como a engenharia metabólica, ajuste das condições de expressão de proteínas, doença detecção e aumentar usando métodos CECF ou CFCF ainda são possíveis, mas podem exigir a experiência com a plataforma CFPS de modificações adicionais de reação condições. Nossos métodos combinam crescimento em meios enriquecidos e frascos perplexos, com métodos relativamente rápidos e reprodutíveis de lise celular através de sonication, seguido de uma configuração simplificada de reação CFPS que utiliza premixes otimizado45. Enquanto os métodos de crescimento celular tem tornar-se um pouco padronizados dentro deste campo, métodos para lise celular variam amplamente. Além de sonication, métodos comuns de Lise incluem a utilização de uma imprensa francesa, um homogenizador, batedores do grânulo, ou lisozima e outras perturbações físicas e bioquímicas métodos46,,47,48, 49. usando nossos métodos, cerca de 2 mL de extrato bruto de celular são obtidos por 1 L de células. Esta quantidade de extrato celular pode oferecer suporte a quatrocentos 15 reações de CFPS µ l, cada produção ~ 900 µ g/mL de proteína de sfGFP repórter do modelo do plasmídeo pJL1-sfGFP. Esse método custa $0,021 / µ g de sfGFP produzido ($.019 / µ l de reação), excluindo o custo de mão de obra e equipamentos (Supplemental Figura 1). A partir do zero, este método pode ser implementado em 4 dias por uma única pessoa e repita as reações CFPS podem ser concluídas dentro de horas (Figura 1). Além disso, o protocolo pode ser escalado em volume para lotes maiores de preparação dos reagentes para atender às necessidades do usuário. Importante, o protocolo aqui apresentado pode ser implementado pelo laboratório treinado não-especialistas como alunos de graduação, pois só requer habilidades básicas de laboratório. Os procedimentos descritos abaixo e o de acompanhamento foram especificamente desenvolvidos para melhorar a acessibilidade da plataforma CFPS Escherichia coli para uso amplo.

Protocol

1. meios preparação e crescimento celular Dia 1 Células de Escherichia coli BL21*(DE3) raia de glicerol um estoque em uma placa de ágar LB e incubam durante pelo menos 18 h a 37 ° C. Prepara-se 50 mL de LB mídia e autoclave a solução em um ciclo de líquido por 30 min a 121 ° C. Armazenar em temperatura ambiente. Dia 2 Prepare 750 mL de 2 x YTP mídia e 250 mL de solução de 0,4 M D-glicose como descrita…

Representative Results

Apresentamos uma base sonication Escherichia coli extrato de protocolo de preparação que pode ser concluído em um período de quatro dias, com a Figura 1 , demonstrando o esgotamento processual ao longo de cada dia. Há maleabilidade para as etapas que podem ser concluídas em cada dia com vários pontos de pausando, mas encontrámos este fluxo de trabalho para ser o mais eficaz executar. Além disso, ambas as pelotas de célula (etapa 1.3.18) e t…

Discussion

Síntese de proteína sem célula tem emergido como uma tecnologia poderosa e propício para uma variedade de aplicações que vão desde biomanufacturing para prototipagem rápida de sistemas bioquímicos. A gama de aplicativos é compatível com a capacidade de monitorar, manipular e aumentar a maquinaria celular em tempo real. Apesar do impacto em expansão desta tecnologia de plataforma, manteve-se ampla adaptação lento devido a nuances técnicas na implementação dos métodos. Através desse esforço, pretendemos…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Autores gostaria de reconhecer o Dr. Jennifer VanderKelen, Andrea Laubscher e Tony Turretto para suporte técnico, Wesley Kao, Layne Williams e Christopher Hight para debates úteis. Os autores reconhecem também apoio financeiro do Bill e fundo de Frost Linda, centro para aplicações em Chevron biotecnologia aplicada pesquisa Endowment Grant da biotecnologia, Cal Poly pesquisa, publicações e programa de concessão de actividades criativas (2017 RSCA), e a National Science Foundation (NSF-1708919). MZL reconhece a Califórnia estado Universidade pós-graduação Grant. MCJ reconhece o escritório da pesquisa da exército W911NF-16-1-0372, National Science Foundation concede MCB-1413563 e MCB-1716766, a força aérea pesquisa laboratório centro de excelência Grant FA8650-15-2-5518, a concessão de agência de redução de ameaça de defesa HDTRA1-15-10052/P00001, o David e Lucile Packard Foundation, o programa de professor erudito Camille Dreyfus, o departamento de energia BER Grant DE-SC0018249, o programa de ciência humana fronteiras (RGP0015/2017), a concessão ETOP DOE Joint Genome Institute, e o consórcio biomédica de Chicago com o apoio dos fundos Searle no Chicago comunidade Trust para apoio.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
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Referências

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

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Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
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