Этот протокол подробно шаги, расходы и оборудование, необходимое для создания E. coli-на основе клеточных экстрактов и реализовать в vitro реакции синтеза белка в течение 4 дней или меньше. Чтобы использовать гибкий характер этой платформы для широкого применения, мы обсуждаем условий реакции, которые могут быть адаптированы и оптимизированы.
За последние 50 лет свободных клеток синтез белка (СЛТ) стала мощной технологии осваивать транскрипционный анализ и трансляционная потенциала клеток в пробирке. Устраняя необходимость поддержания жизнеспособности клетки и устраняя сотовой барьер СЛТ был основополагающим для новых приложений в biomanufacturing традиционно сложных белков, а также приложений в быстрого прототипирования для Метаболический инжиниринг и функциональной геномики. Наши методы для реализации E. coli-платформе СЛТ позволяют новым пользователям для доступа к многим из этих приложений. Здесь мы описываем методы для подготовки экстракт обогащенного СМИ, недоумение колбы и воспроизводимый метод лизис перестраиваемый на основе sonication клеток. Этот экстракт может затем использоваться для выражения протеина, способных производить 900 мкг/мл или более супер папку зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) в как раз 5 h от экспериментальной установки для анализа данных, учитывая, что соответствующий реагент запасы были подготовлены заранее. По оценкам запуска получения реагентов стоит $4500, которая будет поддерживать тысячи реакций по ориентировочной цене $0.021 за мкг белка, произведенного или $0.019 за мкл реакции. Кроме того методы выражения протеина зеркало легкость установки реакции, видели в коммерчески доступных систем за счет оптимизации готовые смеси реагентов, на долю от стоимости. Чтобы разрешить пользователю использовать гибкий характер СЛТ платформы для широкого применения, мы определили целый ряд аспектов платформы, которые могут быть настроены и оптимизированы в зависимости от имеющихся ресурсов и результатов выражения протеина желаемого.
Бесплатный мобильный синтез белка (СЛТ) стала технология, которая разблокирована ряд новых возможностей для производства белка, функциональной геномики, метаболический инжиниринг и более в течение последних 50 лет1,2. По сравнению с стандартным в vivo белка выражение платформ, СЛТ предоставляет три основных преимущества: 1) клетки бесплатный характер платформы позволяет производство белков, которые бы потенциально токсичных или иностранных в ячейке3,4 ,5,6; 2) инактивации геномной ДНК и внедрение шаблона ДНК кодирования gene(s) интерес канал все системные энергии в рамках реакции на производство белки интерес; и 3) открытый характер платформы позволяет пользователю изменять и контролировать условия реакции и композиции в режиме реального времени7,,8. Такой непосредственный доступ к реакции поддерживает увеличение биологических систем с расширенной химия и окислительно-восстановительных условий для производства новых белков и тюнинг метаболических процессов2,9, 10. прямого доступа также позволяет пользователю комбинировать СЛТ реакции с анализов деятельности в системе одного горшок для более быстрого дизайн строить тест циклов11. Способность выполнять СЛТ реакции в малый объем капли или устройств на базе бумаги далее поддерживает усилия обнаружения высокой пропускной способностью и быстрое прототипирование12,13,14,15 ,16. В результате эти преимущества и подключи и играй характер системы, СЛТ однозначно включен разнообразные применения биотехнологии такие как производство белков, которые трудно solubly Экспресс в vivo17, 18,19,20, обнаружение заболевания21,22,23, по требованию biomanufacturing18,24 ,25,26,27и образование28,29, все из которых проявить гибкость и полезность платформы клетки бесплатно.
СЛТ систем могут быть сгенерированы из различных сырой лизатов от обеих линий клеток прокариот и эукариот. Это позволяет для различных вариантов в системе выбор, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки в зависимости от интереса. СЛТ систем также различаются по времени приготовления, стоимости и производительности. Наиболее часто используются ячейки, что экстракты производятся из зародышей пшеницы, кролик ретикулоцитов, насекомое клетки и клетки Escherichia coli , с бытием наиболее экономически эффективных на сегодняшний день при производстве высокий объемный урожайность белка30 . В то время как другие СЛТ системы может быть выгодным для их врожденной столб-поступательные изменения техники, новых приложений с помощью кишечной палочки-на основе техники способны преодолеть разрыв, создавая site-specifically фосфорилированных и гликозилированного белков на спрос31,,3233,34,35.
СЛТ реакции могут выполняться в любом пакете, непрерывный обмен клетки бесплатно (CECF) или непрерывный поток свободных клеток (CFCF) форматы. Формат пакета является закрытой системой, время жизни которого реакции ограничена из-за уменьшения количества реактивов и накопление ингибирующее побочные реакции. Методы CECF и CFCF увеличить время жизни реакции и тем самым привести к повышенной объемной белка урожай по сравнению с пакетной реакции. Это достигается путем предоставления побочных продуктов синтеза белка необходимо удалить из реакции судна, в то время как новые реактивы поставляются в ходе реакции2. В случае CFCF протеин интереса также могут быть удалены из реакционной камеры, в то время как в CECF, протеин интереса остается в реакционной камере, состоящая из36,полупроницаемой мембраны37. Эти методы являются особенно ценными в преодолении бедных объемные урожайности трудно Экспресс белков интерес38,39,40,,4142, 43. Проблемы в реализации CECF и CFCF подходов, что 1) в то время как они приводят к более эффективному использованию механизма био ответственных за транскрипции и трансляции, они требуют особенно больших количеств реагентов, что увеличивает общую стоимость и 2) они требуют более сложных установок реакции и специализированного оборудования, по сравнению с пакетный формат44. Чтобы обеспечить доступность для новых пользователей, протоколы описаного фокус на пакетный формат в реакционных объемов 15 мкл с конкретными рекомендациями для увеличения объема реакции на миллилитр масштаба.
Представленные здесь методы позволяют реализовать рост клеток, извлекать подготовки и пакетная установка реакции формат для е. coliнеспециалистов с основных лабораторных навыков (например, студентов)-на основе системы СЛТ. Этот подход является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступные наборы без ущерба для легкости установки комплекта основе реакции. Кроме того этот подход позволяет приложениям в лаборатории и на местах. При принятии решения о реализации СЛТ, новых пользователей следует тщательно оценить эффективность системах выражения протеина обычных для запуска инвестиций, поскольку СЛТ не могут быть выше в каждом конкретном случае. Описанные здесь методы СЛТ позволяют пользователю напрямую реализовать целый ряд приложений, в том числе функциональной геномики, испытания, производство белков, которые являются неразрешимыми в vivo выражение, а также поле высокой пропускной способности приложения, включая биодатчики и учебных комплектов для синтетической биологии. Дополнительные приложения, такие как метаболический инжиниринг, тюнинг белка выражение условий, обнаружение заболеваний, и масштабирования с помощью методов CECF или CFCF по-прежнему возможны, но может потребовать опыта с платформой СЛТ для дальнейшего изменения реакции условий. Наши методы сочетают в себе рост обогащенного СМИ и озадачен колбы, с относительно быстрым и воспроизводимые методами лизис клеток через sonication, а затем упрощенной установки реакции СЛТ, которая использует оптимизированные премиксы45. Хотя методы клеточного роста стали несколько стандартизированы в этой области, методы для лизиса клеток варьируются в широких пределах. В дополнение к sonication общие лизис методы включают использование французской прессе, гомогенизатор, шарик загонщиков, или лизоцима и другие биохимические и физические нарушения методы46,47,48, 49. с помощью наших методов, примерно 2 мл экстракт сырой клетки получены на 1 Л клеток. Это количество клеток экстракт может поддерживать четыре сотни 15 мкл СЛТ реакции, каждый производства ~ 900 мкг/мл репортер sfGFP белка из шаблона плазмида pJL1-sfGFP. Этот метод по цене $ 0,021/мкг производства sfGFP ($.019/мкл реакции), за исключением стоимости труда и оборудования (Дополнительные рис. 1). Начиная с нуля, этот метод может быть реализован в течение 4 дней одного человека и повторять что СЛТ реакции может быть завершена в течение часов (рис. 1). Кроме того протокол может масштабироваться объема для больших партий реагента подготовки в соответствии с потребностями пользователя. Важно протокола, представленные здесь может быть реализован специалистами лаборатории обучены не-такие как студентов, как он только требует основных лабораторных навыков. Процедуры, описанные ниже и сопровождающие видео были разработаны специально для повышения доступности E. coli СЛТ платформы для широкого использования.
Синтез белков, клеток бесплатно стала мощной и благоприятных технологий для различных приложений, начиная от biomanufacturing быстрое прототипирование биохимических систем. Спектру приложений поддерживают способность контролировать, управлять и увеличить клеточными в режиме реального вре?…
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы признать д-р Дженнифер VanderKelen, Андреа Лаубшер и Тони Turretto технической поддержки, Уэсли Kao, Layne Уильямс и Кристофер Hight полезные обсуждения. Авторы также признают финансовой поддержки от Билла и Линда Фрост фонд, центр для приложений в биотехнологии в Chevron биотехнологии применяются исследовательский фонд Грант, Cal Поли исследовательских, научных и творческой деятельности грантовой программы (RSCA 2017), и Национальный научный фонд (NSF-1708919). MZL признает Калифорнийский государственный университет выпускников Грант. MCJ признает армии исследований бюро W911NF-16-1-0372, Национальный научный фонд предоставляет MCB-1413563 и MCB-1716766, военно-воздушные силы исследований лаборатории центра передового опыта Грант FA8650-15-2-5518, обороны угрозы сокращения агентства грант HDTRA1-15-10052/P00001, Дэвида и Люсиль Пакард, Camille Дрейфус преподаватель стипендиат программы, Департамент из энергии BER Грант де SC0018249, человека границ научной программы (RGP0015/2017), Грант ЭТОП DOE Объединенный институт генома, и Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго доверия сообщества для поддержки.
Luria Broth | ThermoFisher | 12795027 | |
Tryptone | Fisher Bioreagents | 73049-73-7 | |
Yeast Extract | Fisher Bioreagents | 1/2/8013 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
Potassium Phosphate Dibasic | Sigma-Aldrich | 60353-250G | |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma-Aldrich | P9791-500G | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
KOH | Sigma-Aldrich | P5958-500G | |
IPTG | Sigma-Aldrich | I6758-1G | |
Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661-250G | |
K(OAc) | Sigma-Aldrich | P1190-1KG | |
Tris(OAc) | Sigma-Aldrich | T6066-500G | |
DTT | ThermoFisher | 15508013 | |
tRNA | Sigma-Aldrich | 10109541001 | |
Folinic Acid | Sigma-Aldrich | F7878-100MG | |
NTPs | ThermoFisher | R0481 | |
Oxalic Acid | Sigma-Aldrich | P0963-100G | |
NAD | Sigma-Aldrich | N8535-15VL | |
CoA | Sigma-Aldrich | C3144-25MG | |
PEP | Sigma-Aldrich | 860077-250MG | |
K(Glu) | Sigma-Aldrich | G1501-500G | |
NH4(Glu) | MP Biomedicals | 02180595.1 | |
Mg(Glu)2 | Sigma-Aldrich | 49605-250G | |
Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-5G | |
Putrescine | Sigma-Aldrich | D13208-25G | |
HEPES | ThermoFisher | 11344041 | |
Molecular Grade Water | Sigma-Aldrich | 7732-18-5 | |
L-Aspartic Acid | Sigma-Aldrich | A7219-100G | |
L-Valine | Sigma-Aldrich | V0500-25G | |
L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254-25G | |
L-Phenylalanine | Sigma-Aldrich | P2126-100G | |
L-Isoleucine | Sigma-Aldrich | I2752-25G | |
L-Leucine | Sigma-Aldrich | L8000-25G | |
L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C7352-25G | |
L-Methionine | Sigma-Aldrich | M9625-25G | |
L-Alanine | Sigma-Aldrich | A7627-100G | |
L-Arginine | Sigma-Aldrich | A8094-25G | |
L-Asparagine | Sigma-Aldrich | A0884-25G | |
Glycine | Sigma-Aldrich | G7126-100G | |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G3126-250G | |
L-Histadine | Sigma-Aldrich | H8000-25G | |
L-Lysine | Sigma-Aldrich | L5501-25G | |
L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380-100G | |
L-Serine | Sigma-Aldrich | S4500-100G | |
L-Threonine | Sigma-Aldrich | T8625-25G | |
L-Tyrosine | Sigma-Aldrich | T3754-100G | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL | Fisher Scientific | 05-408-138 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit | ThermoFisher | K210007 | |
Ultrasonic Processor | QSonica | Q125-230V/50Hz | 3.175 mm diameter probe |
Avanti J-E Centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
JLA-8.1000 Rotor | Beckman Coulter | 366754 | |
1L Centrifuge Tube | Beckman Coulter | A99028 | |
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask | Sigma-Aldrich | Z710822 | |
Microfuge 20 | Beckman Coulter | B30134 | |
New Brunswick Innova 42/42R Incubator | Eppendorf | M1335-0000 | |
Cytation 5 | BioTek | ||
Strep-Tactin XT Starter Kit | IBA | 2-4998-000 | |
pJL1-sfGFP | Addgene | 69496 | |
BL21(DE3) | New England BioLabs |