JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Кишечная палочка-синтез белка на основе свободных клеток: протоколы для технологии, надежные, гибкие и доступные платформы

Published: February 25, 2019
doi:
10.3791/58882
, , , ,
1Department of Biological Sciences,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology,California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry,California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering,Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute,Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology,Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program,Northwestern University

Summary

Этот протокол подробно шаги, расходы и оборудование, необходимое для создания E. coli-на основе клеточных экстрактов и реализовать в vitro реакции синтеза белка в течение 4 дней или меньше. Чтобы использовать гибкий характер этой платформы для широкого применения, мы обсуждаем условий реакции, которые могут быть адаптированы и оптимизированы.

Abstract

За последние 50 лет свободных клеток синтез белка (СЛТ) стала мощной технологии осваивать транскрипционный анализ и трансляционная потенциала клеток в пробирке. Устраняя необходимость поддержания жизнеспособности клетки и устраняя сотовой барьер СЛТ был основополагающим для новых приложений в biomanufacturing традиционно сложных белков, а также приложений в быстрого прототипирования для Метаболический инжиниринг и функциональной геномики. Наши методы для реализации E. coli-платформе СЛТ позволяют новым пользователям для доступа к многим из этих приложений. Здесь мы описываем методы для подготовки экстракт обогащенного СМИ, недоумение колбы и воспроизводимый метод лизис перестраиваемый на основе sonication клеток. Этот экстракт может затем использоваться для выражения протеина, способных производить 900 мкг/мл или более супер папку зеленого флуоресцентного белка (sfGFP) в как раз 5 h от экспериментальной установки для анализа данных, учитывая, что соответствующий реагент запасы были подготовлены заранее. По оценкам запуска получения реагентов стоит $4500, которая будет поддерживать тысячи реакций по ориентировочной цене $0.021 за мкг белка, произведенного или $0.019 за мкл реакции. Кроме того методы выражения протеина зеркало легкость установки реакции, видели в коммерчески доступных систем за счет оптимизации готовые смеси реагентов, на долю от стоимости. Чтобы разрешить пользователю использовать гибкий характер СЛТ платформы для широкого применения, мы определили целый ряд аспектов платформы, которые могут быть настроены и оптимизированы в зависимости от имеющихся ресурсов и результатов выражения протеина желаемого.

Introduction

Бесплатный мобильный синтез белка (СЛТ) стала технология, которая разблокирована ряд новых возможностей для производства белка, функциональной геномики, метаболический инжиниринг и более в течение последних 50 лет1,2. По сравнению с стандартным в vivo белка выражение платформ, СЛТ предоставляет три основных преимущества: 1) клетки бесплатный характер платформы позволяет производство белков, которые бы потенциально токсичных или иностранных в ячейке3,4 ,5,6; 2) инактивации геномной ДНК и внедрение шаблона ДНК кодирования gene(s) интерес канал все системные энергии в рамках реакции на производство белки интерес; и 3) открытый характер платформы позволяет пользователю изменять и контролировать условия реакции и композиции в режиме реального времени7,,8. Такой непосредственный доступ к реакции поддерживает увеличение биологических систем с расширенной химия и окислительно-восстановительных условий для производства новых белков и тюнинг метаболических процессов2,9, 10. прямого доступа также позволяет пользователю комбинировать СЛТ реакции с анализов деятельности в системе одного горшок для более быстрого дизайн строить тест циклов11. Способность выполнять СЛТ реакции в малый объем капли или устройств на базе бумаги далее поддерживает усилия обнаружения высокой пропускной способностью и быстрое прототипирование12,13,14,15 ,16. В результате эти преимущества и подключи и играй характер системы, СЛТ однозначно включен разнообразные применения биотехнологии такие как производство белков, которые трудно solubly Экспресс в vivo17, 18,19,20, обнаружение заболевания21,22,23, по требованию biomanufacturing18,24 ,25,26,27и образование28,29, все из которых проявить гибкость и полезность платформы клетки бесплатно.

СЛТ систем могут быть сгенерированы из различных сырой лизатов от обеих линий клеток прокариот и эукариот. Это позволяет для различных вариантов в системе выбор, каждая из которых имеет свои преимущества и недостатки в зависимости от интереса. СЛТ систем также различаются по времени приготовления, стоимости и производительности. Наиболее часто используются ячейки, что экстракты производятся из зародышей пшеницы, кролик ретикулоцитов, насекомое клетки и клетки Escherichia coli , с бытием наиболее экономически эффективных на сегодняшний день при производстве высокий объемный урожайность белка30 . В то время как другие СЛТ системы может быть выгодным для их врожденной столб-поступательные изменения техники, новых приложений с помощью кишечной палочки-на основе техники способны преодолеть разрыв, создавая site-specifically фосфорилированных и гликозилированного белков на спрос31,,3233,34,35.

СЛТ реакции могут выполняться в любом пакете, непрерывный обмен клетки бесплатно (CECF) или непрерывный поток свободных клеток (CFCF) форматы. Формат пакета является закрытой системой, время жизни которого реакции ограничена из-за уменьшения количества реактивов и накопление ингибирующее побочные реакции. Методы CECF и CFCF увеличить время жизни реакции и тем самым привести к повышенной объемной белка урожай по сравнению с пакетной реакции. Это достигается путем предоставления побочных продуктов синтеза белка необходимо удалить из реакции судна, в то время как новые реактивы поставляются в ходе реакции2. В случае CFCF протеин интереса также могут быть удалены из реакционной камеры, в то время как в CECF, протеин интереса остается в реакционной камере, состоящая из36,полупроницаемой мембраны37. Эти методы являются особенно ценными в преодолении бедных объемные урожайности трудно Экспресс белков интерес38,39,40,,4142, 43. Проблемы в реализации CECF и CFCF подходов, что 1) в то время как они приводят к более эффективному использованию механизма био ответственных за транскрипции и трансляции, они требуют особенно больших количеств реагентов, что увеличивает общую стоимость и 2) они требуют более сложных установок реакции и специализированного оборудования, по сравнению с пакетный формат44. Чтобы обеспечить доступность для новых пользователей, протоколы описаного фокус на пакетный формат в реакционных объемов 15 мкл с конкретными рекомендациями для увеличения объема реакции на миллилитр масштаба.

Представленные здесь методы позволяют реализовать рост клеток, извлекать подготовки и пакетная установка реакции формат для е. coliнеспециалистов с основных лабораторных навыков (например, студентов)-на основе системы СЛТ. Этот подход является экономически эффективным по сравнению с коммерчески доступные наборы без ущерба для легкости установки комплекта основе реакции. Кроме того этот подход позволяет приложениям в лаборатории и на местах. При принятии решения о реализации СЛТ, новых пользователей следует тщательно оценить эффективность системах выражения протеина обычных для запуска инвестиций, поскольку СЛТ не могут быть выше в каждом конкретном случае. Описанные здесь методы СЛТ позволяют пользователю напрямую реализовать целый ряд приложений, в том числе функциональной геномики, испытания, производство белков, которые являются неразрешимыми в vivo выражение, а также поле высокой пропускной способности приложения, включая биодатчики и учебных комплектов для синтетической биологии. Дополнительные приложения, такие как метаболический инжиниринг, тюнинг белка выражение условий, обнаружение заболеваний, и масштабирования с помощью методов CECF или CFCF по-прежнему возможны, но может потребовать опыта с платформой СЛТ для дальнейшего изменения реакции условий. Наши методы сочетают в себе рост обогащенного СМИ и озадачен колбы, с относительно быстрым и воспроизводимые методами лизис клеток через sonication, а затем упрощенной установки реакции СЛТ, которая использует оптимизированные премиксы45. Хотя методы клеточного роста стали несколько стандартизированы в этой области, методы для лизиса клеток варьируются в широких пределах. В дополнение к sonication общие лизис методы включают использование французской прессе, гомогенизатор, шарик загонщиков, или лизоцима и другие биохимические и физические нарушения методы46,47,48, 49. с помощью наших методов, примерно 2 мл экстракт сырой клетки получены на 1 Л клеток. Это количество клеток экстракт может поддерживать четыре сотни 15 мкл СЛТ реакции, каждый производства ~ 900 мкг/мл репортер sfGFP белка из шаблона плазмида pJL1-sfGFP. Этот метод по цене $ 0,021/мкг производства sfGFP ($.019/мкл реакции), за исключением стоимости труда и оборудования (Дополнительные рис. 1). Начиная с нуля, этот метод может быть реализован в течение 4 дней одного человека и повторять что СЛТ реакции может быть завершена в течение часов (рис. 1). Кроме того протокол может масштабироваться объема для больших партий реагента подготовки в соответствии с потребностями пользователя. Важно протокола, представленные здесь может быть реализован специалистами лаборатории обучены не-такие как студентов, как он только требует основных лабораторных навыков. Процедуры, описанные ниже и сопровождающие видео были разработаны специально для повышения доступности E. coli СЛТ платформы для широкого использования.

Protocol

1. средства массовой информации подготовка и рост клеток 1 день Полоска E. coli BL21*(DE3) клетки от глицерина складе на плиту LB агар и проинкубируйте по крайней мере в 18 ч при 37 ° C. Подготовка 50 мл LB СМИ и автоклав решение на жидких цикла в течение 30 мин при температ?…

Representative Results

Мы представили на основе sonication E. coli экстракт подготовки протокола, который может быть завершен в течение четырех дней, с Рисунок 1 демонстрирует процедурные разбивка на каждый день. Есть податливость шаги, которые могут быть завершены в каждый ден?…

Discussion

Синтез белков, клеток бесплатно стала мощной и благоприятных технологий для различных приложений, начиная от biomanufacturing быстрое прототипирование биохимических систем. Спектру приложений поддерживают способность контролировать, управлять и увеличить клеточными в режиме реального вре?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы признать д-р Дженнифер VanderKelen, Андреа Лаубшер и Тони Turretto технической поддержки, Уэсли Kao, Layne Уильямс и Кристофер Hight полезные обсуждения. Авторы также признают финансовой поддержки от Билла и Линда Фрост фонд, центр для приложений в биотехнологии в Chevron биотехнологии применяются исследовательский фонд Грант, Cal Поли исследовательских, научных и творческой деятельности грантовой программы (RSCA 2017), и Национальный научный фонд (NSF-1708919). MZL признает Калифорнийский государственный университет выпускников Грант. MCJ признает армии исследований бюро W911NF-16-1-0372, Национальный научный фонд предоставляет MCB-1413563 и MCB-1716766, военно-воздушные силы исследований лаборатории центра передового опыта Грант FA8650-15-2-5518, обороны угрозы сокращения агентства грант HDTRA1-15-10052/P00001, Дэвида и Люсиль Пакард, Camille Дрейфус преподаватель стипендиат программы, Департамент из энергии BER Грант де SC0018249, человека границ научной программы (RGP0015/2017), Грант ЭТОП DOE Объединенный институт генома, и Чикаго биомедицинских консорциум с поддержкой от Searle фондов в Чикаго доверия сообщества для поддержки.

Materials

Luria Broth ThermoFisher 12795027
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013
NaCl Sigma-Aldrich S3014-1KG
Potassium Phosphate Dibasic Sigma-Aldrich 60353-250G
Potassium Phosphate Monobasic Sigma-Aldrich P9791-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
DTT ThermoFisher 15508013
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
NH4(Glu) MP Biomedicals 02180595.1
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
HEPES ThermoFisher 11344041
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 2.0 mL Fisher Scientific 05-408-138
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL Fisher Scientific 05-408-129
Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 0.6 mL Fisher Scientific 05-408-120
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50Hz 3.175 mm diameter probe
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Tunair 2.5L Baffeled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
Cytation 5 BioTek
Strep-Tactin XT Starter Kit IBA 2-4998-000
pJL1-sfGFP Addgene 69496
BL21(DE3) New England BioLabs
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203 (2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer’s disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168 (2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514 (2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686 (2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635 (2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399 (2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710 (2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663 (2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. . Transcription and Translation: A Practical Approach. , (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8 (2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34 (2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Tags

Escherichia ColiCell-free Protein SynthesisProtocolPlatform TechnologyFunctional GenomicsBiosensorsMetabolic EngineeringGenetic Code ExpansionCentrifugationS30 BufferDTTResuspensionAliquoting
check_url/pt/58882?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-Based Cell-Free Protein Synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. J. Vis. Exp. (144), e58882, doi:10.3791/58882 (2019).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image