ליפוזום יחיד מדידות לצורך המחקר של משאבות פרוטונים אנזימים ממברנה בעזרת מיקרוסקופ פלואורסצנטי אלקטרוכימיה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון המולקולרי של פרוטון רוברטסונית על פני הממברנות השומנים של ליפוזומים יחיד, ציטוכרום בו3 כדוגמא. שילוב אלקטרוכימיה, מיקרוסקופיה פלורסצנטיות, pH לשינויים לומן של שלפוחית אחת, המכילה יחיד או אנזים מרובים, ועוזרת שנותחו בנפרד.
Abstract
משאבות פרוטונים אנזימים של אלקטרון העברה שרשראות כמה תגובות חמצון-חיזור פרוטון רוברטסונית על פני הקרום, יצירת כוח המניע-פרוטון לייצור ATP. מהות קרום חלבונים amphiphilic דורש תשומת לב מיוחדת לטיפול שלהם, שיחזור לסביבה הטבעית השומנים היא הכרחית עבור לומדים תחבורה תהליכים קרום כמו טרנסלוקציה פרוטון. כאן, אנחנו פירוט שיטת שימש במשך החקירה של מנגנון משאבות פרוטונים של קרום אנזימים חמצון-חיזור, לוקח ציטוכרום בו3 Escherichia coli כדוגמה. שילוב של מיקרוסקופיית אלקטרוכימיה, קרינה פלואורסצנטית משמש כדי לקבוע את מצב חמצון-חיזור quinone בריכה וצג pH השינויים לומן. בגלל שהרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מאות ליפוזומים ניתן למדוד בו זמנית בעוד התוכן האנזים וניתן לשנותם אנזים יחיד או טרנספורטר לכל ליפוזום. ניתוח האנזים יחיד המתאימים יכול לחשוף דפוסים הדינמיקה פונקציונלי של אנזים זה ייתכן אחרת מוסתר על ידי ההתנהגות של כלל האוכלוסייה. אנו כוללים תיאור של קובץ script עבור ניתוח תמונות אוטומטית.
Introduction
מידע על מנגנונים אנזים וקינטיקה מתקבלת בדרך כלל על אנסמבל macroscale הרמה או עם אנזים אוכלוסייה באלפים מיליוני מולקולות, כאשר מידות מייצגים ממוצע סטטיסטי. זה ידוע, עם זאת, כי מקרומולקולות מורכבים כמו אנזימים עשוי להדגים הטרוגניות בהתנהגות שלהם, המנגנונים המולקולריים נצפתה רמה אנסמבל אינם בהכרח חוקיים עבור כל מולקולה. כזה סטיות בסולם מולקולה בודדת בהרחבה אושרו על ידי מחקרים של אנזימים יחיד עם מגוון רחב של שיטות המתעוררים במהלך שני העשורים האחרונים1. ראוי לציין, קרינה פלואורסצנטית גילוי של פעילות אנזים בודדים שימש לחקור הטרוגניות של אנזימים-פעילות-2,–3 או לגלות את אפקט זיכרון כביכול (תקופות של פעילות אנזימים גבוהה על ידי תקופות של לחץ נמוך פעילות ו ולהיפך)4,5.
מחקרים אנזים יחיד רבים דורשים כי האנזימים הם ותשמרו על פני השטח או קבוע במרחב בדרך אחרת להישאר מספיק זמן שם שדה הראייה להשגחה מתמדת. אנזים אנקפסולציה בתוך ליפוזומים הוכח להפעלת האנזים הנייח תוך מניעת כל השפעה שלילית בשל פני השטח-אנזים או חלבון אינטראקציות6,7. בנוסף, ליפוזומים מציעים אפשרות ייחודית ללמוד חלבוני ממברנה אחת שלהם השומנים הטבעיים bilayer הסביבה8,9,10.
מחלקה של קרום חלבונים, מובילים, תרגילים התקה כיוונית של חומרים על פני קרום התא, התנהגות שניתן רק ללמוד כאשר חלבונים הם מחדש לתוך השומנים bilayers (למשל, ליפוזומים)11, 12,13. לדוגמה, רוברטסונית פרוטון, הוצגו על ידי מספר אנזימים רשתות תחבורה אלקטרון prokaryotic ו האיקריוטים, ממלא תפקיד חשוב בנשימה תאית על ידי יצירת כוח המניע-פרוטון המשמש סינתזת ATP. במקרה זה, פרוטונים שאיבה פעילות זה משולב כדי העברת אלקטרונים, למרות מנגנון מפורט של תהליך זה לעיתים קרובות נותרת חמקמקה.
לאחרונה, להדגים את האפשרות זיהוי פלורסנט זוג עם אלקטרוכימיה ללמוד פרוטון שאיבה פעילות של אנזימים יחיד של מסוף ubiquinol אוקסידאז של Escherichia coli (ציטוכרום בו3) מחדש ליפוזומים14. . זה הושג על-ידי ומגעים צבע אטום-ממברנה רגיש pH פלורסנט לתוך לומן של ליפוזומים מקריסטלים של אי coli ליפידים קוטביים (איור 1 א’). כמות חלבון אופטימלי כך רוב ליפוזומים הכיל גם מולקולת אנזים משוקם אין או אחד בלבד (על פי התפלגות פואסון). שני מצעים של ציטוכרום בו3 נמסרו על-ידי הוספת ubiquinone לתערובת השומנים שיצרו ליפוזומים וחמצן (הסביבה) בתמיסה. ליפוזומים הם מכן בדלילות הספוחה על שקוף למחצה ultra-חלקה זהב אלקטרודה, מכוסה טפט שהורכב עצמית של 6-mercaptohexanol. לבסוף, האלקטרודה נטענה על החלק התחתון של תא spectroelectrochemical פשוטה (איור 1B). שליטה אלקטרוכימי של המדינה quinone בריכת חמצון-חיזור מאפשר אחד בגמישות להפעיל או להפסיק את התגובה אנזימטי בכל רגע, בעוד לצבוע רגיש pH משמשת כדי לעקוב אחר השינויים pH בתוך לומן של ליפוזומים כתוצאה פרוטון רוברטסונית מאת אנזימים. על-ידי שימוש ניתן לקבוע את עוצמת קרינה פלואורסצנטית השני, השומנים מכורך הפלורסנט, גודל ונפח של ליפוזומים בודדים ובכך כימות של אנזים פרוטון שאיבה פעילות. בעזרת טכניקה זו, ובייחוד מצאנו כי ציטוכרום בו3 מולקולות מסוגלים להיכנס למצב הדליפה ספונטנית כי כלתה במהירות את הכוח המניע של פרוטון. המטרה של מאמר זה היא להציג את הטכניקה של ליפוזום יחיד מדידות בפירוט.
Protocol
Representative Results
Discussion
השיטה המתוארת מתאימה ללמוד פרוטון שאיבה על ידי חלבונים ממברנה הנשימה יכולה להיות מחדש לתוך ליפוזומים והם מסוגלים להחליף אלקטרונים עם הבריכה quinone. פרוטון שאיבה פעילות ניתן לנטר ברמת אנזים יחיד באמצעות צבעי רגיש pH (רציומטרי) במארז ליפוזום לומן (איור 1 א’).
השיט?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים להכיר את BBSRC (BB/P005454/1) עבור תמיכה כספית. מלון NH מומן על-ידי התוכנית חוקר צעיר קרן VILLUM.
Materials
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
Referências
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. . Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work?. Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA – Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. . Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. . Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
