電気化学と蛍光顕微鏡を用いたプロトン ポンプ膜酵素の研究のための単一リポソーム測定
Summary
ここでは、プロトコルを提案単一リポソームの脂質膜を渡るプロトン透過の分子機構の研究例としてシトクロムbo3を使用します。電気化学、蛍光顕微鏡、単一小胞、含む単一または複数の酵素のルーメン内の pH の変化を組み合わせることを検出および分析できる個別に。
Abstract
電子のプロトン ポンプの酵素は ATP の生産に使用されるプロトン動機力を作成する、膜プロトン透過経路にチェーン カップル酸化還元反応を転送します。両親媒性膜タンパク質性の取り扱いには特に注意が必要ですし、プロトン透過経路のような膜輸送プロセスを勉強するとき、天然脂質環境に再構築は不可欠であります。ここで、例として大腸菌由来シトクロムbo3を取って膜酸化還元酵素のプロトン ポンプ機構の調査のために使用されている方法は詳細します。内腔のキノン プールとモニターの pH 変化の酸化還元状態を制御するは、電気化学および蛍光顕微鏡に組み合わせてです。酵素のコンテンツは、単一の酵素やトランスポーター リポソームあたりにスケール ダウンすることができますしながら蛍光顕微鏡の空間分解能によるリポソームの何百も同時に測定できます。それぞれ単一の酵素分析は、それ以外の場合全体の人口の行動によって隠されるかもしれない酵素機能動態のパターンを明らかにできます。我々 は、自動画像解析用スクリプトの説明を含めます。
Introduction
酵素機構と反応速度論については、測定値が統計平均を表す酵素分子の数百万人に何千人もの人口を持つアンサンブルまたはマクロ レベルで通常取得されます。それは、ただし、酵素など複雑な高分子の行動における不均一性を発揮、アンサンブルのレベルで観察される分子メカニズムが必ずしも当てはまらないすべての分子のために知られています。最後の二十年の1中に新興の方法の様々 な個々 の分子スケールのような逸脱が広く単一酵素の研究によって確認されました。特に、個々 の酵素活動を蛍光検出は、酵素活動2,3の不均一性を調査したり、いわゆるメモリー効果 (低の期間によって成功した高い酵素活性の期間を発見に使用されています活動と逆)4,5。
多くの単一の酵素の研究は、酵素表面または空間的固定連続観測の視野で十分な長さのままに別の方法でに固定されている必要があります。酵素カプセル化リポソーム表面酵素または蛋白質蛋白質の相互作用の6,7による悪影響を防止しながら酵素固定化を有効にするのに示されています。また、リポソームは、その天然の脂質二分子膜環境の8,9,10で単一膜蛋白質を研究するユニークな可能性を提供しています。
膜タンパク質、トランスポーター、クラス蛋白質は脂質二重膜 (例えばリポソーム)11に再構成されたときにだけ勉強することができます動作、セル膜を渡る物質の方向転流を練習します。 12,13。たとえば、プロトン透過経路、原核生物と真核生物の電子輸送鎖のいくつかの酵素によって展示は ATP 合成に使用されるプロトン動機力を作成することによって細胞呼吸において重要な役割を果たしています。この場合、多くの場合このプロセスの詳細なメカニズムは、とらえどころのないままがプロトン ポンプ機能は電子伝達と結合されます。
最近では、プロトン ポンプの大腸菌(シトクロムbo3) ターミナル ユビキノール酸化酵素の単一の酵素の活性を研究する電気化学とカップル蛍光検出する可能性を示した14リポソームに再構成しました。これEからリポソームの内腔 pH 感応膜不浸透性蛍光色素のカプセル化によって達成されました。大腸菌極性脂質 (図 1 a)。タンパク質の量は、ほとんどリポソームは (ポアソン分布) によるとないまたは 1 つだけ溶解酵素の分子をも含んだに最適化されていました。シトクロムbo3の 2 枚の基板は、ユビキノンをソリューションでリポソームと (アンビエント) 酸素を形成脂質ミックスに追加することによって提供されました。リポソームは半透明な超滑らかな金電極、6 mercaptohexanol の自己組織化膜で覆われているまばら吸着します。最後に、電極は簡単な分光電気化学セル (図 1 b) の下部にマウントされています。キノン プールの酸化還元状態の電気化学的制御により、柔軟にトリガーしたり、または pH 感受性色素によってプロトン透過の結果としてリポソームのルーメン内の pH の変化を監視するために使用中にいつでもでも酵素反応を停止する 1 つ、酵素。使用して 2 番目、脂質バインド蛍光染料、サイズおよび個々 のリポソームのボリュームの蛍光強度を決定することができます、このように酵素のプロトン ポンプ機能の定量化。この手法を使用すると、特にわかったシトクロムbo3分子がプロトン動機力をすばやく消える自然リーク状態に入ることができます。この記事の目的は、詳細に単一リポソーム測定の手法を紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
記載されているメソッドは、プロトン ポンプ リポソームに再構成することができます呼吸膜タンパク質の研究に適してキノン プールと電子を交換することができます。プロトン ポンプ機能は、pH に敏感な (レシオ) 染料リポソーム ルーメン (図 1 a) でカプセル化を使用して単一酵素レベルで監視できます。
メソッドは、サム18電?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、BBSRC (BB/P005454/1) の金融支援を認めます。NH は、VILLUM 財団若手研究者プログラムによって資金を供給されました。
Materials
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
Referências
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