Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri
Summary
Burada, proton translocation moleküler mekanizması tek lipozomlar, lipid membranlar üzerinde çalışmak için bir protokol sitokrom bo3 örnek olarak kullanarak mevcut. Birleştirerek elektrokimya ve floresan mikroskopisi, lumen tek veziküller, tek içeren veya birden fazla enzim, pH değişiklikler algıladı ve ayrı ayrı analiz.
Abstract
Elektron, Proton pompa enzimler zincirleri çift Redoks reaksiyonları proton translocation için ATP üretimi için kullanılan bir proton-sebep kuvvet oluşturma membran arasında aktarın. Membran proteinlerinin amfifilik doğası kullandıklarında daha özel dikkat gerektirir ve membran taşıma işlemleri proton translocation gibi okurken sulandırma doğal lipid ortamına vazgeçilmezdir. Burada, biz Escherichia coli örnek olarak sitokrom bo3 alarak membran Redoks enzimler, proton pompa mekanizması soruşturma için kullanılan bir yöntem ayrıntılı. Elektrokimya ve floresan mikroskopi bir arada quinone havuzu ve monitör pH değişiklikleri Lümen Redoks durumunu kontrol etmek için kullanılır. Floresan mikroskopi Uzaysal çözünürlük nedeniyle, lipozomlar yüzlerce enzim içeriği bir tek enzim ya da ışınlama lipozom başına ölçeklendirilebilir iken aynı anda ölçülebilir. İlgili tek enzim analizi okuduğunuzda, aksi takdirde tüm popülasyon davranış tarafından gizlenmiş olabilir enzim fonksiyonel dinamiklerini ortaya çıkarabilir. Otomatik görüntü analizi için bir komut dosyası için bir açıklama içerir.
Introduction
Enzim mekanizmaları ve Kinetik hakkında bilgi genellikle nerede bir istatistiksel ortalama ölçümleri temsil topluluğu veya macroscale düzeyde moleküller, milyonlarca binlerce enzim nüfus ile elde edilir. Bu, ancak, enzim kompleksi oluştururlar heterojenite onların davranış görülebilir ve moleküler mekanizmaları topluluk düzeyinde gözlenen her molekül için mutlaka geçerli değildir bilinmektedir. Bu tür sapmalar bireysel molekül ölçekte kapsamlı çalışmaları tek enzimler tarafından son yirmi yılda1sırasında ortaya çıkan yöntemler ile onaylandı. Özellikle, Floresans algılama bireysel enzim aktivitesinin enzim aktivitesi2,3 heterojen araştırmak veya sözde hafıza etkisi (düşük noktalarla başarılı yüksek enzim etkinlik dönemleri keşfetmek için kullanılan etkinlik ve tersi)4,5.
Birçok tek enzim çalışmaları enzimleri yüzey veya yeterince uzun sürekli gözlem için görüş alanı içinde kalmak için başka bir şekilde dağınık şekilde sabit immobilize gerektirir. Enzim kapsülleme lipozomlar içine herhangi bir olumsuz etkisi nedeniyle yüzey-enzim veya protein-protein etkileşimleri6,7önleme sırasında enzim tutuklaması etkinleştirileceği gösterilmiştir. Buna ek olarak, lipozomlar tek zar proteinleri onların doğal lipid bilayer çevre8,9,10eğitim için benzersiz bir imkanı verir.
Membran proteinlerinin, taşıyıcı, sınıf bir yön translocation maddelerin hücre zarı, proteinler lipid bilayers (örneğin, lipozomlar)11yeniden yükleyen sadece okudu bir davranış karşısında egzersizleri, 12,13. Örneğin, proton translocation prokaryotik ve ökaryotik elektron taşıma zinciri, çeşitli enzimler tarafından sergilenen, ATP sentezi için kullanılan bir proton-güdü güç oluşturarak önemli bir rol hücresel solunum oynar. Bu durumda, her ne kadar bu işlem detaylı mekanizmasının kez zor kalır etkinlik pompalama proton elektron transferi için birleştirilmiştir.
Son zamanlarda, Escherichia coli (sitokrom bo3) terminal ubiquinol oksidaz tek enzim aktivitesi pompalama proton çalışmaya elektrokimya ile çift floresan algılama olasılığı gösterdi lipozomlar14‘ te yeniden düzenlendi. Bu bir pH duyarlı membran geçirimsiz floresan boya E. hazırlanan lipozomlar Lümen içine encapsulation sağlanır coli kutup lipidler (şekil 1A). Böylece çoğu lipozomlar ya yok ya da sadece bir Sulandırılan enzim molekül (göre Poisson dağılımı) içerdiği protein miktarı optimize edildi. Sitokrom bo3 iki yüzeylerde ubiquinone lipozomlar ve (ortam) oksijen çözümde oluşturulan lipid karışımı ekleyerek temin edilmiştir. Lipozomlar sonra seyrek 6-mercaptohexanol otomatik olarak birleştirilmiş bir monolayer ile kaplı bir yarı saydam yumușak altın elektrot üzerinde adsorbe. Son olarak, elektrot bir basit Spektroelektrokimyasal hücre (şekil 1B) altta monte edilir. Quinone havuzu Redoks durumu elektrokimyasal kontrol sağlar bir esnek tetiklemek için veya pH duyarlı boya proton translocation tarafından bir sonucu olarak lipozomlar Lümen içinde pH değişiklikleri izlemek için kullanıldığı gibi her an enzimatik reaksiyon durdurmak için enzimler. Bir ikinci, lipid bağlı floresan boya, boyutu ve bireysel lipozomlar hacmi floresan yoğunluğu belirlenebilir ve enzim proton pompalama aktivitesi miktar kullanılarak böylece. Bu tekniği kullanarak, sitokrom bo3 molekülleri hızla proton sebep kuvvet kalır bir spontan kaçak durumuna girebilmesi için özellikle bulduk. Bu makalenin amacı tek lipozom ölçümleri ayrıntılı teknik tanıtmaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Açıklanan yöntemi tarafından lipozomlar yeniden solunum membran proteinlerinin pompalama proton çalışmaya uygundur ve quinone havuzu ile elektron alış verişi edebiliyoruz. Proton pompalama aktivitesi, lipozom Lümen (şekil 1A) kapsüllenmiş pH-duyarlı (ratiometric) boyalar kullanılarak tek-enzim düzeyinde izlenebilir.
Yöntemi ile bir SAM18değiştiren elektrotlar ile elektron alışverişi için yeteneğine ubiquinone (veya …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar mali destek için BBSRC (1/P005454/BB) kabul etmiş oluyorsunuz. NH VILLUM Vakfı genç araştırmacı programı tarafından finanse edildi.
Materials
| 6-Mercapto-1-hexanol (6MH) | Sigma | 451088 | 97% |
| 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) | BioChemika | 56360 | |
| Aluminium holder (Electrochemical cell) | Custom-made | 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm | |
| Auxiliary electrode | platinum wire | ||
| Chloroform | VWR Chemicals | 83627 | |
| E.coli polar lipids | Avanti | 100600C | 25 mg/mL in chloroform |
| Epoxy | EPO-TEK | 301-2FL | low fluorescence epoxy |
| Fiji (ImageJ 1.52d) | Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) | ||
| Filter cube ("ATTO633") | Chroma Technology Corporation | Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm | |
| Filter cube ("HPTS1") | Chroma Technology Corporation | Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("HPTS2") | Chroma Technology Corporation | Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm | |
| Filter cube ("Texas Red") | Chroma Technology Corporation | Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm | |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) | ThermoFisher Scientific | T1395MP | TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm) |
| Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) | ATTO-TEC | AD 633-161 | ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm) |
| Gel filtration column | GE Healthcare | 28-9893-33 | HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0172 | No 1.5 |
| Glass syringe | Hamilton | 1725 RNR | 250 µL |
| Glass vials | Scientific Glass Laboratories Ltd | T101/V1 | 1.75 mL capacity |
| Gold | GoodFellow | 99.99% | |
| Gramacidin | Sigma | G5002 | |
| Mercury sulfate reference electrode | Radiometer (Hash) | E21M012 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | Minispin NL040 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Microscope Camera | Andor | Zyla 5.5 sCMOS | |
| Microscope Lamp | Nikon | Intensilight C-HGFI | |
| NIS-Elements AR 5.0.2 | Nikon | Microscope acquisition software | |
| n-Octyl β-D-glucopyranoside | Melford Laboratories | B2007 | |
| Nova 1.10 | Metrohm | Potentiostat control software | |
| Objective | Nikon | Plan Apo λ 60x/1.4 oil | |
| OriginPro 2017 | OriginLab | Plotting software | |
| O-ring (Electrochemical cell) | Orinoko | Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm | |
| Plastic tubes | Eppendorf | 3810X | 1.5 mL |
| Polystyrene microbeads | Bio-RAD | 152-3920 | Biobeads, 20-50 mesh |
| Potentiostat | Metrohm Autolab | PGSTAT 128N | |
| Potentiostat | CH Instruments | CHI604C | |
| Scripting software | Matlab | R2017a | Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox' |
| Silicon wafers | IDB Technologies LTD | Si-C2 (N<100>P) | Ø 25 mm, 525 um thick |
| Teflon cell (Electrochemical cell) | Custom-made | Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm | |
| Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces | Platypus Technologies | AU.1000.SWTSG | Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand) |
| Thin micropipette tips | Sarstedt | 70.1190.100 | or similar gelloader tips 200 µL |
| Ubiquinone-10 | Sigma | C-9538 | |
| Ultracentrifuge | Beckman-Coulter | L-80XP | with Ti 45 rotor |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB15063 |
Referências
- Claessen, V. I., et al. Single-Biomolecule Kinetics: The Art of Studying a Single Enzyme. Annual Review of Analytical Chemistry. 3 (1), 319-340 (2010).
- Rojek, M. J., Walt, D. R. Observing Single Enzyme Molecules Interconvert between Activity States upon Heating. PLoS ONE. 9 (1), e86224 (2014).
- Velonia, K., et al. Single-Enzyme Kinetics of CALB-Catalyzed Hydrolysis. Angewandte Chemie International Edition. 44 (4), 560-564 (2005).
- Lu, H. P., Xun, L., Xie, X. S. . Single-molecule enzymatic dynamics. 282 (5395), 1877-1882 (1998).
- Engelkamp, H., Hatzakis, N. S., Hofkens, J., De Schryver, F. C., Nolte, R. J. M., Rowan, A. E. Do enzymes sleep and work?. Chemical Communications. 9 (9), 935-940 (2006).
- Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. Immobilization in Surface-Tethered Lipid Vesicles as a New Tool for Single Biomolecule Spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry B. 105 (48), 12165-12170 (2001).
- Hsin, T. -. M., Yeung, E. S. Single-Molecule Reactions in Liposomes. Angewandte Chemie International Edition. 46 (42), 8032-8035 (2007).
- García-Sáez, A. J., Schwille, P. Single molecule techniques for the study of membrane proteins. Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).
- Onoue, Y., et al. A giant liposome for single-molecule observation of conformational changes in membrane proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1788 (6), 1332-1340 (2009).
- Jefferson, R. E., Min, D., Corin, K., Wang, J. Y., Bowie, J. U. Applications of Single-Molecule Methods to Membrane Protein Folding Studies. Journal of Molecular Biology. 430 (4), 424-437 (2018).
- Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins. BBA – Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).
- Jesorka, A., Orwar, O. Liposomes: Technologies and Analytical Applications. Annual Review of Analytical Chemistry. 1 (1), 801-832 (2008).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: Not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Li, M., et al. Single Enzyme Experiments Reveal a Long-Lifetime Proton Leak State in a Heme-Copper Oxidase. Journal of the American Chemical Society. 137 (51), 16055-16063 (2015).
- Rumbley, J. N., Furlong Nickels, E., Gennis, R. B. One-step purification of histidine-tagged cytochrome bo3 from Escherichia coli and demonstration that associated quinone is not required for the structural integrity of the oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Protein Structure and Molecular Enzymology. 1340 (1), 131-142 (1997).
- Jeuken, L. J. C., et al. Phase separation in mixed self-assembled monolayers and its effect on biomimetic membranes. Sensors and Actuators, B: Chemical. 124 (2), 501-509 (2007).
- Barsoukov, E., Macdonald, J. R. . Impedance Spectroscopy Theory, Experiment, and Applications. , (2005).
- Jeuken, L. J. C., Connell, S. D., Henderson, P. J. F., Gennis, R. B., Evans, S. D., Bushby, R. J. Redox Enzymes in Tethered Membranes. Journal of the American Chemical Society. 128 (5), 1711-1716 (2006).
- Compton, R. G., Banks, C. E. Chapter 4. Understanding voltammetry. , (2018).
- Girault, H. H. Chapter 10. Analytical and Physical Electrochemistry. , (2004).
- Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. . Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application. , (2018).
- Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes. Biochimica et Biophysica Acta – Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . MATLAB code for the analysis of proton transport activity in single liposomes. , (2017).
- Li, M., Tuma, R., Jeuken, L. J. C. . Time-resolved fluorescence microscopic data (traces) of individual lipid vesicles with proton transport activity. , (2017).
- Paula, S., Volkov, A. G., Van Hoek, A. N., Haines, T. H., Deamer, D. W. Permeation of protons, potassium ions, and small polar molecules through phospholipid bilayers as a function of membrane thickness. Biophysical Journal. 70 (1), 339-348 (1996).
- Brookes, P. S., Hulbert, A. J., Brand, M. D. The proton permeability of liposomes made from mitochondria) inner membrane phospholipids: No effect of fatty acid composition. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Biomembranes. 1330 (2), 157-164 (1997).
- Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane. Biochimica et Biophysica Acta – Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).
- Seneviratne, R., et al. A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability. Methods. , 1-8 (2018).
- Veshaguri, S., et al. Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase. Science. 351 (6280), 1-6 (2016).
