मेसो स्केल कण इमेज Velocimetry Neurovascular में बहता है इन विट्रो का अध्ययन
Summary
यहां हम पारदर्शी neurovascular प्रेतों के निर्माण के लिए सरलीकृत तरीके प्रस्तुत करते है और उसमें प्रवाह को निस्र्पक करते हैं । हम कई महत्वपूर्ण मापदंडों पर प्रकाश डाला और क्षेत्र सटीकता के लिए उनके रिश्ते को प्रदर्शित करता है ।
Abstract
कण छवि velocimetry (PIV) खेतों की एक विस्तृत विविधता में प्रयोग किया जाता है, यह ठीक visualizing और एक बड़ी spatiotemporal रेंज भर में प्रवाह को बढ़ाता है के लिए प्रदान करता है अवसर के कारण । हालांकि, इसके कार्यांवयन आम तौर पर महंगी और विशेष उपकरण है, जो अपने व्यापक उपयोगिता सीमा के उपयोग की आवश्यकता है । इसके अलावा, में इंजीनियरिंग के क्षेत्र के भीतर, इन विट्रो प्रवाह दृश्य अध्ययन भी अक्सर आगे वाणिज्यिक स्रोत ऊतक प्रेतों की उच्च लागत द्वारा सीमित कर रहे हैं कि दोहराऊंगा वांछित संरचनात्मक संरचनाओं, विशेष रूप से उन लोगों के लिए कि स्पैन mesoscale शासन (यानी, मिलीमीटर लंबाई तराजू करने के लिए) । इस के साथ साथ, हम एक सरल प्रयोगात्मक इन सीमाओं को संबोधित विकसित प्रोटोकॉल वर्तमान, जिनमें से प्रमुख तत्वों 1) mesoscale ऊतक 3-डी मुद्रण और सिलिकॉन कास्टिंग का उपयोग कर प्रेतों के निर्माण के लिए एक अपेक्षाकृत कम लागत विधि शामिल है, और 2) एक खुला स्रोत छवि विश्लेषण और प्रसंस्करण ढांचे कि mesoscale प्रवाह को मापने के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन पर मांग को कम कर देता है (यानी, वेग अप करने के लिए मिलीमीटर की दसियों/ सामूहिक रूप से, यह पहले से ही कई इंजीनियरिंग शोधकर्ताओं के निपटान में संसाधनों का लाभ द्वारा, विशेषज्ञताओं के लिए प्रवेश करने के लिए बाधा कम करती है. हम neurovascular प्रवाह लक्षण वर्णन के संदर्भ में इस प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता demonstratethe; हालांकि, यह mesoscale अनुप्रयोगों की एक व्यापक श्रृंखला के लिए प्रासंगिक और इंजीनियरिंग से परे होने की उंमीद है ।
Introduction
PIV व्यापक रूप से प्रवाह दृश्य और द्रव गति की मात्रात्मक जांच के लिए प्रयोगात्मक द्रव यांत्रिकी में प्रयोग किया जाता है जो वायुमंडल से लम्बाई के पैमाने में बदलती है microcirculatory प्रवाह1,2,3। जबकि इसके कार्यांवयन के विशिष्ट रूप में अपने आवेदन के रूप में व्यापक रूप से भिंन हो सकते हैं, एक लगभग सभी PIV अध्ययन के लिए आम पहलू काम तरल पदार्थ के भीतर वरीयता प्राप्त अनुरेखक कणों के वीडियो इमेजिंग का उपयोग है, एक जोड़ी के बाद लगातार छवि फ्रेम के वार विश्लेषण वांछित प्रवाह विशेषताओं को निकालने के लिए । आमतौर पर, यह पहली बार छोटे क्षेत्रों में एक छवि फ्रेम विभाजित द्वारा पूरा किया है पूछताछ खिड़कियां । बिखरे हुए कणों के यादृच्छिक पदों का एक परिणाम के रूप में, प्रत्येक पूछताछ खिड़की पिक्सेल तीव्रता का एक अनूठा वितरण होता है । यदि खिड़की के आकार और डेटा अधिग्रहण दर उचित रूप से चुना जाता है, प्रत्येक खिड़की में तीव्रता संकेत के पार सहसंबंध है कि क्षेत्र के भीतर औसत विस्थापन का अनुमान लगाया जा सकता है । अंत में, यह देखते हुए कि आवर्धन और फ्रेम दर प्रयोगात्मक मापदंडों जाना जाता है, एक तात्कालिक वेग वेक्टर क्षेत्र आसानी से गणना की जा सकती है ।
एकल बिंदु माप तकनीक पर PIV का एक बड़ा लाभ एक दो या तीन आयामी डोमेन भर में वेक्टर क्षेत्रों को मैप करने की क्षमता है । Hemodynamic अनुप्रयोगों, विशेष रूप से, इस क्षमता से लाभांवित किया है, क्योंकि यह स्थानीय प्रवाह की एक पूरी तरह से जांच की अनुमति देता है, जो संवहनी रोग में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए जाना जाता है या remodeling (जैसे, atherosclerosis, angiogenesis) 4 , 5 , 6. यह भी गया है neurovascular प्रवाह के मूल्यांकन के लिए सच है, और अंतर्वाहिकी उपकरणों के साथ बातचीत (जैसे, प्रवाह लोंगो, stents, intrasaccular कुंडल), के बाद से प्रासंगिक लंबाई-तराजू ऐसे अनुप्रयोगों में कर सकते है अक्सर परिमाण के एक या अधिक आदेश (उदाहरणके लिए, माइक्रोमीटर मिलीमीटर से) अवधि, और डिवाइस ज्यामिति और स्थान काफी स्थानीय द्रव यांत्रिकी7प्रभाव कर सकते हैं ।
अधिकांश समूहों PIV आयोजित hemodynamic अध्ययन आधारित प्रयोगात्मक सेट अप पर भरोसा किया है कि बारीकी से संवहनी प्रवाह7,8पर स्टेंट प्रभाव की जल्द से जल्दी जांच के कुछ नकल । आमतौर पर, ये एक) स्पंदित पराबैंगनीकिरण और उच्च गति कैमरों में शामिल हैं, उच्च वेग प्रवाह को पकड़ने के लिए; ख) तुल्यकालन, लेजर और कैमरा अधिग्रहण फ्रेम दर की नब्ज आवृत्ति के बीच एलियासिंग को रोकने के लिए; ग) बेलनाकार प्रकाशिकी, एक प्रकाश चादर बनाने के लिए और, इस प्रकार, ऊपर और पूछताछ विमान के नीचे अनुरेखक कणों से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को कम; घ) वाणिज्यिक बारी के मामले में प्रमुख प्रणालियों, मालिकाना सॉफ्टवेयर संकुल, परस्पर सहसंबंध विश्लेषण करने के लिए । हालांकि, जबकि कुछ अनुप्रयोगों के प्रदर्शन की आवश्यकता होती है और/या बहुमुखी प्रतिभा सामूहिक रूप से इन घटकों द्वारा afforded, कई अंय नहीं है । इसके अलावा, वाणिज्यिक स्रोत ऊतक प्रेतों कि दोहराऊंगा वांछित संवहनी संरचनाओं की उच्च लागत भी इन विट्रो अध्ययनों में कई के लिए सीमित साबित कर सकते हैं, विशेष रूप से प्रेतों के लिए सुविधाओं के साथ कि पुल mesoscale शासन (> ५०० USD/ प्रेत). इस के साथ साथ, हम neurovascular प्रवाह है, जो आम तौर पर दोनों स्थानिक और अस्थाई mesoscale शासन के भीतर झूठ की इन विट्रो दृश्य में PIV के लिए लागू करने के लिए एक सरलीकृत प्रोटोकॉल के विकास की रिपोर्ट (यानी, लंबाई को लेकर तराजू मिलीमीटर से मिलीमीटर, और वेग अप करने के लिए दसियों मिलीमीटर/ प्रोटोकॉल पहले से ही कई इंजीनियरिंग शोधकर्ताओं के निपटान में संसाधनों का लाभ उठाने के लिए चाहता है, इस प्रकार के लिए विशेषज्ञताओं के लिए प्रवेश को कम करने की बाधा.
इस प्रोटोकॉल का पहला तत्व एक निवेश कास्टिंग तकनीक के उपयोग को सक्षम करने के लिए पारदर्शी, polydimethylsiloxane (PDMS) के घर निर्माण-3 से आधारित ऊतक प्रेतों-डी मुद्रित बलि molds शामिल है । हाल के वर्षों में 3-डी प्रिंटर्स की बढ़ती उपलब्धता का लाभ उठाते हुए, विशेष रूप से उन साझा/बहु-उपयोगकर्ता सुविधाओं (जैसे, संस्थागत सुविधाएं या सार्वजनिक makerspaces) में, इस पद्धति में कटौती की काफी लागत आती है (उदा., < १०० USD/प्रेत मामले में यहां प्रस्तुत), जबकि डिजाइन और geometries की एक विस्तृत विविधता के निर्माण के लिए एक तेजी से बदलाव को सक्षम करने । वर्तमान प्रोटोकॉल में, एक जुड़े जमाव मॉडलिंग प्रणाली के निर्माण सामग्री के रूप में acrylonitrile ब्यूटाडाइन styrene (ABS) के साथ प्रयोग किया जाता है, और मुद्रित भाग बाद प्रेत कास्टिंग के लिए एक बलि मोल्ड के रूप में कार्य करता है । हमारे अनुभव से पता चला है कि ABS अच्छी तरह से इस तरह के उपयोग के लिए अनुकूल है, क्योंकि यह आम सॉल्वैंट्स में घुलनशील है (जैसे, एसीटोन), और यह पर्याप्त शक्ति और कठोरता के लिए समर्थन सामग्री को हटाने के बाद मोल्ड अखंडता बनाए रखने के लिए है (जैसे, विकृति या छोटा मोल्ड सुविधाओं के फ्रैक्चर को रोकने) । वर्तमान प्रोटोकॉल में, मोल्ड अखंडता आगे ठोस मुद्रित मॉडल का उपयोग कर सुनिश्चित है, हालांकि इस वृद्धि विघटन समय की कीमत पर आता है । खोखले मॉडल का उपयोग भी कुछ मामलों में संभव हो सकता है, विलायक का उपयोग बढ़ाने के लिए, और इस प्रकार, विघटन समय को कम । हालांकि, सावधान विचार यह मोल्ड अखंडता पर हो सकता है प्रभाव के लिए दिया जाना चाहिए । अंत में, जबकि प्रेतों के साथ साथ यहां गढ़े neurovascular संरचनाओं के आदर्श अभ्यावेदन पर आधारित है एक आम कंप्यूटर डिजाइन सहायता प्राप्त (सीएडी) सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर उत्पंन, प्रोटोकॉल के लिए और अधिक जटिल के निर्माण के लिए उत्तरदाई होने की उंमीद है , रोगी विशेष geometries के रूप में अच्छी तरह से (उदाहरणके लिए, मॉडल नैदानिक इमेजिंग डेटा के रूपांतरण द्वारा उत्पंन फ़ाइलों के उपयोग के माध्यम से । अधिकांश 3-डी प्रिंटर्स द्वारा उपयोग किया गया फ़ाइल स्वरूप STL) । इसके अलावा प्रेत निर्माण प्रक्रिया के बारे में जानकारी प्रोटोकॉल की धारा 2 में प्रदान की जाती हैं ।
प्रोटोकॉल का दूसरा तत्व एक खुले स्रोत प्लग के उपयोग के लिए ImageJ के लिए परस्पर सहसंबंध विश्लेषण9आचरण शामिल है । यह एक सरल सांख्यिकीय थ्रेसहोल्ड योजना के कार्यांवयन के साथ युग्मित है (यानी, तीव्रता कैपिंग)10 छवि संकेत पार करने से पहले सुधार करने के लिए सहसंबंध, साथ ही साथ एक postcorrelation वेक्टर सत्यापन योजना, सामान्यीकृत माध्य टेस्ट (NMT), अपने निकटतम पड़ोसियों11के लिए प्रत्येक की तुलना के माध्यम से नकली वैक्टर को खत्म करने के लिए । सामूहिक रूप से, इस इमेजिंग आमतौर पर कई इंजीनियरिंग प्रयोगशालाओं में पाया उपकरणों का उपयोग कर पूरा किया जा करने की अनुमति देता है, इस प्रकार ठेठ PIV प्रणालियों के महंगा घटकों के कई के अधिग्रहण के लिए की जरूरत को नष्ट करने (जैसे, लेजर स्पंदित, तुल्यकालन, बेलनाकार प्रकाशिकी, और मालिकाना सॉफ्टवेयर) । इसके अलावा वीडियो संग्रह, छवि प्रसंस्करण, और डेटा विश्लेषण के बारे में जानकारी प्रोटोकॉल के वर्गों 5 और 6 में प्रदान की जाती हैं ।
चित्रा 1 PIV सेट-अप इस प्रोटोकॉल, जो इमेजिंग के लिए एक उच्च गति कैमरे के साथ सुसज्जित एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर निर्भर करता है, साथ ही एक बाहरी, निरंतर सफेद प्रकाश स्रोत (यानी, धातु halide लैंप) में इस्तेमाल किया दिखाताहै थ्रू-वस्तुनिष्ठ volumetric दीप्ति । एक चर गति गियर पंप neurovascular ऊतक प्रेतों के माध्यम से एक पारदर्शी नकली रक्त समाधान के परिसंचारी प्रवाह थोपने के लिए प्रयोग किया जाता है । समाधान के एक 60:40 मिश्रण से बना है (DI) पानी और ग्लिसरॉल, जो hemodynamic अध्ययन में रक्त के लिए एक आम विकल्प है12,13,14, एक के कारण) इसके समान घनत्व और चिपचिपापन (यानी, १,०८० किग्रा/एम3 और ३.५ सीपी बनाम १,०५० किग्रा/एम3 और 3-5 सीपी के लिए रक्त)15,16; ख) दिखाई रेंज में अपनी पारदर्शिता; ग) PDMS के रूप में अपने समान अपवर्तन सूचकांक (१.३८ बनाम PDMS के लिए १.४२)17,18,19,20, जो ऑप्टिकल विरूपण को कम करता है ; घ) आसानी के साथ जो गैर ंयूटोनियन व्यवहार शुरू किया जा सकता है, अगर जरूरत है, xanthane21के अलावा के माध्यम से । अंत में, फ्लोरोसेंट polystyrene मोती अनुरेखक कणों के रूप में उपयोग किया जाता है (व्यास में १०.३ µm; ४८० एनएम/501 एनएम उत्तेजना/उत्सर्जन) । जबकि तटस्थ रूप से बोया मोती वांछित हैं, इष्टतम द्रव यांत्रिक गुणों के साथ अनुरेखक कणों सोर्सिंग (जैसे, घनत्व, आकार, संरचना) और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य चुनौतीपूर्ण साबित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यहां इस्तेमाल किया मोतियों से थोड़ा कम घने है ग्लिसरॉल समाधान (१,०५० किग्रा/एम3 बनाम १,०८० kg/ हालांकि, hydrodynamic प्रभाव, तत्संबंधी, नगण्य हैं, यह देखते हुए कि एक ठेठ प्रयोग की अवधि अब तक उछाल प्रभाव के साथ जुड़े समय पैमाने से कम है (यानी, 5 मिनट और 20 मिनट, क्रमशः) । इसके अलावा नकली रक्त समाधान निर्माण और इन विट्रो में संचार प्रणाली सेट अप के बारे में जानकारी के वर्गों 3 और 4 प्रोटोकॉल में प्रदान की जाती हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां वर्णित प्रोटोकॉल PIV अध्ययन प्रदर्शन करने के लिए शारीरिक रूप से प्रासंगिक आयामों पर neurovascular बहती कल्पना और इन विट्रो मेंप्रवाह की स्थिति के लिए एक सरलीकृत विधि रूपरेखा । ऐसा करने में, यह दूसरों है ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक यूसी नदी के किनारे पर अनुसंधान और आर्थिक विकास के कार्यालय से एक सहयोगी बीज अनुदान द्वारा प्रदान की गई इस परियोजना के लिए आंशिक समर्थन स्वीकार करते हैं ।
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
Referências
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