Meso-escala partícula imagen Velocimetry estudios neurovasculares flujos In Vitro
Summary
Aquí presentamos métodos simplificados para fabricación neurovascular transparentes fantasmas y caracterizar el flujo en el mismo. Destacar varios parámetros importantes y demostrar su relación con la precisión del campo.
Abstract
Imagen de partícula velocimetry (PIV) se utiliza en una amplia variedad de campos, debido a la oportunidad que ofrece para precisamente visualizar y cuantificar los flujos a través de una amplia gama de spatiotemporal. Sin embargo, su ejecución requiere típicamente el uso de instrumentos costosos y especializados, que limita su utilidad más amplia. Por otra parte, dentro del campo de la bioingeniería, en vitro estudios de visualización de flujo son también a menudo más limitado por el alto costo de fantasmas comercialmente con tejido que recapitular estructuras anatómicas deseadas, particularmente para aquellos que abarcar el régimen de mesoescala (es decir, submilimétricas a escalas de longitud milímetro). Adjunto, presentamos un protocolo experimental simplificado desarrollado para hacer frente a estas limitaciones, los elementos clave que incluyen 1) un método de costo relativamente bajo para la fabricación de mesoescala fantasmas de tejido mediante impresión 3-d y bastidor de la silicona y 2) marco de análisis y procesamiento de imágenes de código abierto que reduce la demanda sobre la instrumentación para la medición de flujos de mesoescala (es decir, velocidades de hasta decenas de milímetros/segundo). Colectivamente, esto reduce la barrera de entrada para nonexperts, mediante el aprovechamiento de recursos ya a disposición de muchos investigadores de Bioingeniería. Demonstratethe aplicación de este protocolo en el contexto de la caracterización del flujo de neurovascular; sin embargo, se espera a ser relevantes para una amplia gama de aplicaciones de mesoescala en Bioingeniería y más allá.
Introduction
PIV es ampliamente utilizado en mecánica de fluidos experimental para visualización de flujo e Investigaciones cuantitativas de movimiento fluido que varía en la escala de longitud de atmosférico a flujo microcirculatorio1,2,3. Mientras que los específicos de su aplicación pueden variar tan ampliamente como sus aplicaciones, un aspecto común a casi todos los estudios PIV es el uso de imágenes de video de partículas trazadoras sembradas dentro del líquido de trabajo, seguido por un análisis de pares de fotogramas de la imagen consecutiva para extraer las características de flujo deseada. Por lo general, esto se logra por primer subdividiéndose cada fotograma de la imagen en regiones más pequeñas como windows interrogatorio. Como consecuencia de las posiciones al azar de las partículas dispersas, cada ventana de interrogatorio contiene una única distribución de intensidades de píxeles. Si la tasa de adquisición de datos y tamaño de ventana se elige apropiadamente, la correlación cruzada de la señal de intensidad en cada ventana se puede utilizar para estimar el desplazamiento promedio en esa región. Por último, dado que la ampliación y la velocidad de fotogramas se conocen parámetros experimentales, un campo del vector velocidad instantánea puede ser computado fácilmente.
Una ventaja importante de PIV sobre técnicas de medición de un solo punto es su capacidad para asignar campos del vector en un dominio de dos o tres dimensiones. Aplicaciones hemodinámicas, en particular, se han beneficiado de esta capacidad, ya que permite una investigación exhaustiva de corrientes locales, lo que se sabe que juega un papel importante en la enfermedad vascular o remodelación (p. ej., ateroesclerosis, angiogénesis) 4 , 5 , 6. esto ha sido cierto para la evaluación de los flujos de neurovascular, y las interacciones de éstos con los dispositivos endovasculares (p. ej., desviadores de flujo, stents, bobinas de intrasaccular), desde las escalas de la longitud relevantes en este tipo de aplicaciones pueden a menudo abarcan uno o más órdenes de magnitud (por ejemplo, del micrómetro al milímetro) y geometría del dispositivo y colocación puede afectar significativamente la mecánica de fluidos locales7.
Mayoría de los grupos realización de estudios hemodinámicos basados en la PIV ha confiado en configuraciones experimentales que mímico de cerca algunas de las primeras investigaciones de stent influencia sobre el flujo vascular7,8. Por lo general, se trata de un) pulsada láser y cámaras de alta velocidad, para captar flujos de alta velocidad; b) sincronizadores, para prevenir aliasing entre la frecuencia del pulso del láser y la velocidad de fotogramas de adquisición cámara; c) óptica cilíndrica, para formar una ficha técnica de iluminación y, así, minimizar la fluorescencia de fondo de partículas trazadoras por encima y por debajo del plano de interrogatorio; d) en el caso de sistemas comerciales llave en mano, paquetes de software propietario, para realizar los análisis de correlación cruzada. Sin embargo, mientras que algunas aplicaciones requieren el rendimiento y versatilidad que colectivamente estos componentes, muchos otros no. Además, el alto costo del tejido comercialmente con fantasmas que recapitulan estructuras vasculares deseadas también pueden resultar limitante para muchos estudios en vitro , particularmente para fantasmas con cuenta que puente el régimen de mesoescala (> 500 USD / fantasma). Adjunto, Divulgamos el desarrollo de un protocolo simplificado para la aplicación de PIV para la visualización en vitro de corrientes neurovascular, que típicamente se encuentran tanto espacial y temporalmente dentro del régimen de mesoescala (es decir, escalas de longitud que van de submilimétricas al milímetro y velocidades de hasta decenas de milímetros/segundo). El protocolo pretende aprovechar los recursos ya a disposición de muchos investigadores de bioingeniería, disminuyendo la barrera de entrada para nonexperts.
El primer elemento de este protocolo incluye el uso de una técnica de fundición de inversión para permitir la fabricación interna de transparente, polydimethylsiloxane (PDMS)-basado en fantasmas de tejido de 3-D-impreso moldes sacrificiales. Aprovechando la creciente disponibilidad de las impresoras 3D en los últimos años, particularmente aquellos en compartido y multiusuario instalaciones (p. ej., instalaciones institucionales o makerspaces pública), esta metodología reduce los costes significativamente (por ejemplo, < 100 USD/fantasma en el caso presentado aquí), al tiempo que permite un cambio rápido para la fabricación de una amplia variedad de diseños y geometrías. En el protocolo actual, una deposición fundida modelado de sistema se utiliza con acrilonitrilo butadieno estireno (ABS) como el material de construcción, y la parte impresa sirve como un molde sacrificial para el posterior bastidor phantom. Nuestra experiencia ha demostrado que ABS es adecuado para tal uso ya que es soluble en los solventes comunes (por ejemplo, acetona), y tiene suficiente fuerza y rigidez para mantener la integridad del molde después de remover el material de apoyo (por ejemplo, a evitar la deformación o fractura de características diminuto molde). En el actual protocolo, integridad del moldes más se asegura mediante modelos impresos sólidos, aunque esto viene a expensas de tiempo de mayor disolución. El uso de modelos hueco también es posible en algunos casos, para mejorar el acceso de solvente y por lo tanto, reducir el tiempo de la disolución. Sin embargo, debe prestarse atención cuidadosa al efecto esto puede tener sobre la integridad del moldes. Finalmente, mientras los fantasmas fabricados en este documento se basan en representaciones idealizadas de las estructuras neurovasculares generadas usando un paquete de software de diseño asistido por ordenador (CAD) común, el protocolo se espera que sea favorable a la fabricación de más complejos , específico para cada paciente geometrías así (p. ej., mediante el uso de archivos del modelo generado por la conversión de datos de imágenes clínicas a la. STL formato de archivo utilizado por la mayoría de las impresoras 3-d). Más detalles sobre el proceso de fabricación fantasma se proporcionan en el artículo 2 del protocolo.
El segundo elemento del protocolo implica el uso de un código abierto plug-in para ImageJ para llevar a cabo el análisis de correlación cruzada9. Esto junto con la implementación de un esquema simple umbral estadístico (es decir, intensidad límite)10 para mejorar la señal de imagen antes de la correlación cruzada, así como un esquema de validación de postcorrelation vector, el normalizado prueba de la mediana (NMT), para eliminar falsas vectores a través de una comparación de cada uno de sus más cercanos vecinos11. En conjunto, esto permite obtener imágenes para lograrse usando equipos comúnmente encontrados en muchos laboratorios de bioingeniería, así eliminando la necesidad de la adquisición de muchos de los costosos componentes de los sistemas PIV típicos (p. ej., láser pulsado, sincronizador, óptica cilíndrica y software propietario). Más detalles sobre la colección de vídeos, procesamiento de imágenes y análisis de datos se proporcionan en las secciones 5 y 6 del protocolo.
La figura 1 ilustra la configuración PIV usada en este protocolo, que se basa en un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de alta velocidad para la proyección de imagen, así como un externo, fuente de luz blanca continua (es decir, lámpara de halogenuro metálico) para iluminación volumétrica a través del objetivo. Una bomba de engranaje de velocidad variable se utiliza para imponer el flujo de recirculación de una solución de sangre falsa transparente a través de los fantasmas del tejido neurovascular. La solución se compone de una mezcla de 60: 40 de desionizada (DI) agua y glicerol, que es un sustituto común para sangre en hemodinámica estudia12,13,14, debido a una) su densidad y viscosidad (es decir, similar 1.080 kg/m3 y 3.5 cP vs 1.050 kg/m3 y 3-5 cP sangre)15,16; b) su transparencia en la gama visible; c) su índice de refracción similar como PDMS (1.38 vs 1,42 para PDMS)17,18,19,20, que minimiza la distorsión óptica; d) la facilidad con que puede introducirse los comportamiento no newtoniano, de ser necesario, mediante la adición de xanthane21. Por último, granos del poliestireno fluorescentes se utilizan como partículas Trazadoras (10,3 μm de diámetro; 480 nm/501 nm excitación/emisión). Mientras que se desean que los granos de flotabilidad neutra, puede resultar difícil abastecimiento partículas trazadoras con óptimas propiedades mecánicas fluidos (p. ej., densidad, tamaño, composición) y longitud de onda de emisión. Por ejemplo, los granos utilizados aquí son un poco menos densos que la solución de glicerol (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). Sin embargo, los efectos hidrodinámicos, son insignificantes, dado que la duración de un experimento típico es mucho más corta que la escala de tiempo asociada con los efectos de la flotabilidad (es decir, 5 min y 20 min, respectivamente). Más detalles sobre el sistema circulatorio configuración formulación y en vitro de sangre falsa solución se proporcionan en las secciones 3 y 4 del protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito aquí describe un método simplificado para realizar estudios PIV para visualizar neurovascular fluye en dimensiones relevantes fisiológicamente y flujo condiciones in vitro. De esta manera, sirve para complementar los protocolos registrados por otros que también se han centrado en la simplificación de la cuantificación de campos del vector, pero dentro de contextos muy diferentes que requieren que la consideración de la mucho mayor longitud de escalas de25 o me…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen el apoyo parcial para este proyecto proveído por una beca semilla de colaboración de la oficina de investigación y desarrollo económico en UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
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