Meso-skala partikel billede Velocimetri undersøgelser af neurovaskulære strømme In Vitro
Summary
Her præsenterer vi forenklede metoder til opdigte gennemsigtig neurovaskulære phantoms og kendetegner strømmen deri. Vi fremhæve flere vigtige parametre og vise deres forhold til feltet nøjagtighed.
Abstract
Partikel billede Velocimetri (PIV) bruges i en lang række felter, på grund af mulighed for giver netop visualisere og kvantificere strømme på tværs af et stort spatiotemporelle område. Dets gennemførelse kræver dog typisk brug af dyre og specialiserede instrumentering, som begrænser dens bredere nytte. Desuden inden for bioteknologi, in vitro- flow visualisering undersøgelser er også ofte yderligere begrænset af de høje udgifter til kommercielt producerede væv phantoms, at sammenfatte ønskede anatomiske strukturer, især for dem, der span mesoscale regime (dvs., submillimeter til millimeter længdeskalaer). Heri, præsenterer vi en forenklet eksperimentel protokol udviklet til at håndtere disse begrænsninger, de centrale elementer som omfatter 1) en relativt billig metode til at opdigte mesoscale væv phantoms ved hjælp af 3D-udskrivning og silikone støbning, og 2) et Open-source image analyse og behandling ramme, der reducerer efterspørgslen efter instrumenterne til måling af mesoscale flow (dvs., hastigheder op til ti millimeter/sekund). Kollektivt, sænker det adgangsbarriere for nonexperts, ved at udnytte ressourcer allerede til rådighed for mange bioteknologi forskere. Vi demonstratethe anvendeligheden af denne protokol inden for rammerne af neurovaskulære flow karakterisering; Det forventes dog at være relevante for en bredere vifte af mesoscale programmer i bioteknologi og videre.
Introduction
PIV er meget udbredt i eksperimentel fluid mekanik til flow visualisering og kvantitative undersøgelser af glidende bevægelser, der varierer i længde skala fra atmosfæriske microcirculatory strømme1,2,3. Mens de nærmere enkeltheder i dets gennemførelse kan variere så bredt som dens applikationer, er et aspekt fælles for næsten alle PIV undersøgelser brugen af video billeddannelse af tracer partikler seedede inden for arbejdsvæsken, efterfulgt af en parvise analyse af sammenhængende billedrammer at udvinde ønskede flydeegenskaber. Dette opnås typisk ved første inddele hver billedramme i mindre regioner kaldes forhør windows. Som følge af de spredte partikler tilfældige holdninger indeholder hver forhør vindue en entydig fordeling af pixel intensiteter. Hvis vinduet størrelse og data erhvervelse sats er valgt korrekt, kan cross-korrelation af intensitet signal i hvert vindue bruges til at estimere den gennemsnitlige forskydning inden for dette område. Endelig, at forstørrelse og framerate er kendt eksperimentelle parametre, en øjeblikkelige hastighed vektor felt kan let beregnes.
En stor fordel af PIV over single-point måleteknikker er dens evne til at knytte vektorfelter på tværs af et to – eller tre – dimensionelle domæne. Hæmodynamiske programmer, især har nydt godt af denne evne, da det giver mulighed for en grundig undersøgelse af lokale strømme, der er kendt for at spille en væsentlig rolle i vaskulær sygdom eller remodellering (fx, åreforkalkning, angiogenese) 4 , 5 , 6. dette har også været tilfældet for evaluering af neurovaskulære strømme, og interaktioner heraf med Intravaskulært udstyr (f.eks.flow omdirigeringsmaskiner stenter, og intrasaccular spoler), siden de relevante længdeskalaer i sådanne ansøgninger kan strækker sig over ofte en eller flere ordrer størrelsesorden (f.eks.fra mikrometer til millimeter), og enheden geometri og placering kan betydeligt påvirke den lokale fluid mekanik7.
De fleste grupper PIV-baserede hæmodynamiske undersøgelser har stolet på eksperimentelle opstillinger, der nøje efterligner nogle af de tidligste undersøgelser af stent indflydelse på vaskulære flow7,8. Typisk, disse omfatter en) impuls lasere og højhastigheds kameraer til at fange høj hastighed strømme; b) Synchronizere, at forhindre aliasing mellem puls hyppigheden af laser og kamera erhvervelse frame rate; c) cylindrisk optik, danner en lys plade og dermed minimere baggrund fluorescens fra tracer partikler over og under forhør fly; d) i kommercielle nøglefærdige systemer, proprietære software-pakker til at udføre Kors-sammenhæng-analyser. Dog mens nogle programmer kræver ydeevne og/eller alsidighed kollektivt som disse komponenter, mange andre gør ikke. Desuden, den høje pris på kommercielt producerede væv phantoms at sammenfatte ønskede vaskulære strukturer kan også bevise begrænsning for mange in vitro- undersøgelser, navnlig for spøgelser med funktioner denne bro mesoscale regime (> 500 USD / Phantom). Heri, rapporterer vi udviklingen af en forenklet protokol for at gennemføre PIV til in vitro- visualisering af neurovaskulære strømme, der typisk ligger både rumligt og tidsligt inden for mesoscale regimet (dvs.længdeskalaer spænder fra submillimeter til millimeter, og hastigheder op til ti millimeter/sekund). Protokollen har til formål at udnytte ressourcerne allerede til rådighed for mange bioteknologi forskere, hvilket vil mindske adgangsbarriere for nonexperts.
Det første element i denne protokol indebærer anvendelse af en investering støbning teknik hen til muliggøre den in-house fabrikation af gennemsigtige, Polydimethylsiloxan (PDMS)-baseret væv phantoms fra udskrives 3 3-d opoffrende forme. Ved at udnytte den øgede tilgængelighed af 3D-printere i de seneste år, navnlig i delt/multi-multi-user faciliteter (f.eks., institutionelle faciliteter eller offentlige makerspaces), denne metode skærer omkostningerne betydeligt (f.eks.< 100 USD/phantom i tilfælde præsenteres her), samtidig med at en hurtig ekspeditionstid til fremstilling af en bred vifte af designs og geometrier. I den nuværende protokol, et sammenvokset deposition modellering system bruges med acrylonitril butadien styren (ABS) som byggemateriale og den udskrevne del fungerer som en opoffrende mold til de efterfølgende phantom støbning. Vores erfaring har vist at ABS er velegnet til sådan anvendelse, da det er opløseligt i fælles opløsningsmidler (fx, acetone), og det har tilstrækkelig styrke og stivhed til at opretholde skimmel integritet efter fjernelse af support-materiale (f.eks., at forhindre deformation eller brud på diminutive skimmel funktioner). I den nuværende protokol, er skimmel integritet yderligere sikret ved hjælp af solid trykte modeller, selv om det kommer på bekostning af øget opløsning tid. Brugen af hule modeller kan også være muligt i nogle tilfælde, at forbedre opløsningsmiddel adgang, og således reducere opløsningen tid. Dog forsigtig bør overvejes om, at dette kan have på mug integritet. Endelig, mens phantoms fabrikeret heri er baseret på idealiserede repræsentationer af neurovaskulære strukturer genereret ved hjælp af en fælles computerstøttet design (CAD) programmel pakke, protokollen er forventes at være modtagelig til fabrikation af mere komplekse , patient-specifikke geometrier samt (f.eks. via brugen af modelfiler genereret af kliniske billeddiagnostiske data til konvertering af. STL filformat, der bruges af de fleste 3D-printere). Yderligere detaljer vedrørende fantom fabrikationsproces er fastsat i punkt 2 i protokollen.
Det andet element i protokollen indebærer anvendelse af en open-source plug-in for ImageJ at gennemføre cross-korrelation analyser9. Dette er kombineret med gennemførelsen af en simple statistiske tærskel ordning (i.e., intensitet capping)10 at forbedre billedet signal forud for Kors-sammenhæng, samt en postcorrelation vektor efterprøvelse ordning, den normaliserede Median test (NMT), at fjerne spurious vektorer gennem en sammenligning af hver til sin nærmeste naboer11. Kollektivt, giver dette imaging at være udført ved hjælp af udstyr, der er almindeligt forekommende i mange laboratorier, bioteknologi, hvilket eliminerer behovet for erhvervelse af mange af de dyre komponenter af typiske PIV-systemer (fx, pulserende laser, Synchronizer, cylindrisk optik, og proprietær software). Yderligere detaljer vedrørende videosamling, billedbehandling og analyse af data er fastsat i afsnit 5 og 6 i protokollen.
Figur 1 illustrerer PIV set-up bruges i denne protokol, som er afhænger af et fluorescens mikroskop udstyret med en høj hastighed kamera til billedbehandling, samt en ekstern, kontinuerlig hvid-lyskilde (dvs., metalhalogen lampe) for gennem mål volumetriske belysning. En variabel hastighed gear pumpe bruges til at indføre en gennemsigtig mock blod løsning gennem neurovaskulære væv phantoms recirkulerende strømmen. Løsningen består af en 60: 40 blanding af deioniseret (DI) vand og glycerol, som er en fælles erstatning for blod i hæmodynamiske undersøgelser12,13,14, skyldes en) dens lignende tæthed og viskositet (dvs., 1,080 kg/m3 og 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 og 3-5 cP for blod)15,16; b) dens gennemsigtighed i det synlige spektrum; c) dens tilsvarende brydningsindeks som PDMS (1,38 vs 1.42 til PDMS)17,18,19,20, som minimerer optisk forvrængning; d) den lethed, hvormed der kan indføres ikke-newtonske adfærd, hvis det er nødvendigt, via tilføjelsen af xanthane21. Endelig, fluorescerende polystyren perler er brugt som tracer partikler (10,3 µm i diameter, 480 nm/501 nm excitation/emission). Mens neutralt livlig perler er ønsket, kan sourcing tracer partikler med optimal flydende mekaniske egenskaber (f.eks.massefylde, størrelse, sammensætning) og emission bølgelængde blive en udfordring. For eksempel, er Perlerne anvendes heri lidt mindre tætte end glycerol løsning (1.050 kg/m3 vs 1,080 kg/m3). Dog de hydrodynamiske virkninger heraf, er ubetydelig, idet varigheden af en typisk eksperiment er langt kortere end tidshorisonten tilknyttet opdrift effekter (dvs., 5 min og 20 min, henholdsvis). Yderligere er detaljer vedrørende mock blod løsning formulering og in vitro- kredsløbssygdomme set-up fastsat i afsnit 3 og 4 i denne protokol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen beskrevet heri skitserer en forenklet metode til at udføre PIV undersøgelser for at visualisere neurovaskulære flyder på fysiologisk relevante dimensioner og flow betingelser in vitro. Dermed, tjener det til at supplere protokoller rapporteret af andre, der har også fokuseret på at forenkle kvantificering af vektorfelter, men i meget forskellige sammenhænge, der kræver overvejelse af langt større længde skalaer25 eller lavere flow satser26<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkende delvis støtte til dette projekt leveret af kollaborative frø tilskud fra Office for forskning og økonomiske udvikling på UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
Referências
- Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).
- Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9 (17), 2551 (2009).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
- Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).
- Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23 (11), (2013).
- Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).
- Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).
- Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).
- Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. . Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. , (2007).
- Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).
- Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).
- Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).
- Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).
- Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).
- Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).
- Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
- Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9 (12), 113762 (2014).
- Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505 (2012).
- Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285 (2000).
- Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).
- Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).
- Kuo, C. -. C., Mao, R. -. C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).
- Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12 (1), 014105 (2018).
- Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).
- Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).
- Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).
- Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).
- Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).
- Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).
- Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
- Tsai, W., Savaş, &. #. 2. 1. 4. ;. Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).
- Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).
