Meso-schaal Particle Image Velocimetry Studies van neurovasculaire stroomt In Vitro
Summary
Hier presenteren we vereenvoudigde methoden voor het fabriceren van transparante neurovasculaire fantomen en daarin het karakteriseren van de stroom. Wij wijzen op verschillende belangrijke parameters en tonen hun relatie tot veld nauwkeurigheid.
Abstract
Particle image velocimetry (PIV) wordt gebruikt in een breed scala aan velden, als gevolg van de mogelijkheid die het voorziet juist visualiseren en kwantificeren van stromen in een heel grote Spatio scala. Echter vereist de uitvoering ervan meestal het gebruik van dure en gespecialiseerde instrumentatie, waardoor het nut van ervan breder wordt beperkt. Bovendien, op het gebied van de studierichtingen Bio-ingenieur, in vitro stroom visualisatie studies zijn ook vaak verder beperkt door de hoge kosten van commercieel geproduceerde weefsel fantomen die gewenste anatomische structuren, met name voor degenen recapituleren die span het MESOSCHAAL regime (dat wil zeggen, submillimeter naar millimeter lengte schalen). Hierin presenteren wij een vereenvoudigde experimenteel protocol ontwikkeld voor het pakken van deze beperkingen, de belangrijkste elementen van die 1) een relatief goedkope methode voor het fabriceren van MESOSCHAAL weefsel phantoms met behulp van 3D-printen en siliconen gieten bevatten, en 2) een open-source image analyse en verwerking kader dat de aanvraag van de instrumentatie vermindert voor het meten van MESOSCHAAL stromen (d.w.z., snelheden tot tientallen millimeters/seconde). Collectief, verlaagt dit de toetredingsdrempel voor nonexperts, door gebruik te maken van middelen reeds ter beschikking van vele bioengineering onderzoekers. We demonstratethe toepasselijkheid van dit protocol binnen de context van de karakterisering van de stroom van de neurovasculaire; echter naar verwachting relevant zijn voor een breder scala van toepassingen van de MESOSCHAAL in de studierichtingen Bio-ingenieur en daarbuiten.
Introduction
PIV wordt het veel gebruikt in de experimentele stromingsleer voor stroom visualisatie en kwantitatieve onderzoeken van vloeiende bewegingen die in lengte schaal van atmosferische tot microcirculatory stromen1,2,3 variëren. Hoewel de specifieke kenmerken van de uitvoering ervan zo breed als de toepassingen variëren kunnen, is een aspect gemeen hebben bijna alle PIV studies het gebruik van video beeldvorming van tracer deeltjes uitgezaaid binnen het werkmedium, gevolgd door een paarsgewijse analyse van opeenvolgende afbeeldingsframes uitpakken van gewenste flow eigenschappen. Meestal is dit bereikt door het eerste controledoeleinden elk frame van de afbeelding in kleinere regio’s ondervraging windows genoemd. Als gevolg van de willekeurige posities van de verspreide deeltjes bevat elke ondervraging venster een unieke verdeling van pixel intensiteiten. Als het venster grootte en gegevens verwerving tarief geschikt zijn gekozen, kan cross-correlatie van het signaal van de intensiteit in elk venster worden gebruikt om te schatten de gemiddelde verplaatsing binnen dat gebied. Ten slotte, gezien het feit dat de vergroting en de framesnelheid bekend zijn experimentele parameters, een vectorveld momentane snelheid kan worden gemakkelijk berekend.
Een groot voordeel van PIV over één-punt meettechnieken is haar vermogen om de kaart van vectorvelden binnen een domein op twee – of drie – dimensional. Hemodynamische toepassingen, met name baat hebben gehad bij deze mogelijkheid, aangezien hierdoor een grondig onderzoek van lokale stromen, waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen bij vaatziekten of het remodelleren (b.v., atherosclerose, angiogenese) 4 , 5 , 6. is dit ook het geval voor de evaluatie van neurovasculaire stromen geweest, en de interacties daarvan met endovasculaire apparaten (bijvoorbeeldstroom omleiders, stents, intrasaccular spoelen), sinds de relevante lengte-schalen in dergelijke toepassingen kunnen vaak omvatten een of meer ordes van grootte (b.v.van micrometer en millimeter), en apparaat geometrie en plaatsing kan beduidend beïnvloeden de lokale stromingsleer7.
De meeste groepen in orkestdirectie PIV gebaseerde hemodynamische hebben vertrouwd op experimentele set-ups die enkele van de vroegste onderzoeken van stent invloed vasculaire stroom7,pt8nauw na te bootsen. Meestal deze omvatten een) gepulseerde lasers en high-speed camera’s, om vast te leggen hoge-snelheid stromen; b) synchronisatieprocessen, om te voorkomen dat aliasing tussen de frequentie van de pols van de laser en de camera acquisitie framesnelheid; c) cilindrische optica, te vormen van een lichte blad, dus het minimaliseren van de fluorescentie van de achtergrond van tracer deeltjes boven en beneden de ondervraging vlak; d) in het geval van de commerciële kant en klare systemen, propriëtaire softwarepakketten, de cross-correlatie-analyses uitvoeren. Nochtans, terwijl sommige toepassingen vereisen de prestaties en/of de veelzijdigheid collectief die worden geboden door deze onderdelen, vele anderen dat niet doen. Bovendien, de hoge kosten van commercieel geproduceerde weefsel fantomen die gewenste vasculaire structuren recapituleren kunnen ook blijken beperken voor veel in vitro studies, met name voor spoken met beschikt over die brug het MESOSCHAAL regime (> 500 USD / “Phantom”). Hierin, rapporteren we de ontwikkeling van een vereenvoudigde protocol voor de uitvoering van PIV voor de visualisatie in vitro van neurovasculaire stromen, die meestal beide ruimtelijk liggen en stoffelijk binnen het MESOSCHAAL regime (dat wil zeggen, lengte schalen variërend van submillimeter millimeter, en snelheden tot tientallen millimeters/seconde). Het protocol beoogt aan hefboomwerking de middelen reeds ter beschikking van vele bioengineering onderzoekers, dus het verlagen van de toetredingsdrempel voor nonexperts.
Het eerste element van dit protocol omvat het gebruik van een techniek gieten investering om de eigen fabricage van transparante, Polydimethylsiloxaan (PDMS)-op basis van weefsel spoken van opofferende mallen 3-d-3-d-afgedrukt. Door de toenemende beschikbaarheid van 3D-printers in de afgelopen jaren, met name die in gedeelde/multi-eindgebruiker voorzieningen (bijvoorbeeld, institutionele voorzieningen of openbare makerspaces), deze methode verlaagt kosten aanzienlijk (bijvoorbeeld< 100 USD/phantom in de hier voorgelegde geval), terwijl het toelaten van een snelle ommekeer voor de fabricage van een grote verscheidenheid van ontwerpen en geometrieën. In het huidige protocol, een fused deposition modeling systeem wordt gebruikt met acrylonitril butadieen styreen (ABS) als het bouwmateriaal, en het afgedrukte gedeelte fungeert als een offer mal voor het latere phantom gieten. Onze ervaring is gebleken dat ABS geschikt voor dergelijk gebruik, is aangezien het is oplosbaar in gemeenschappelijke oplosmiddelen (bijv., aceton), en het heeft voldoende sterkte en stijfheid aan schimmel integriteit behouden na de verwijdering van het dragermateriaal (b.v., om voorkomen dat de vervorming of breuk van het verkleinwoord schimmel functies). In het huidige protocol, wordt schimmel integriteit verder verzekerd met behulp van solide gedrukte modellen, hoewel dit ten koste van de toegenomen ontbinding tijd gaat. Het gebruik van holle modellen ook mogelijk in sommige gevallen, te verbeteren oplosmiddel toegang en dus ontbinding tijd te verminderen. Echter zorgvuldig moet worden overwogen om het effect dit kan hebben op de integriteit van de schimmel. Tot slot, terwijl de fantomen vervaardigd hierin zijn gebaseerd op geïdealiseerde voorstellingen van neurovasculaire structuren gegenereerd met behulp van een gemeenschappelijke computer aided design (CAD)-softwarepakket, het protocol zal naar verwachting worden vatbaar voor de fabricage van meer complexe , patiënt-specifieke geometrieën evenals (bijvoorbeeld via het gebruik van model-bestanden gegenereerd door de conversie van de klinische beeldvorming gegevens aan de. STL bestandsindeling die wordt gebruikt door de meeste 3D-printers). Verdere details met betrekking tot de phantom Productie-procédé vindt u in sectie 2 van het protocol.
Het tweede element van het protocol omvat het gebruik van een open-source plug-in voor ImageJ uit te voeren van de cross-correlatie analyse9. Dit is in combinatie met de uitvoering van een eenvoudige statistische drempelmethode actie (dat wil zeggen, intensiteit aftopping)10 ter verbetering van het signaal van de afbeelding voorafgaand aan cross-correlatie, evenals een postcorrelation vector validatie regeling, de genormaliseerde mediane test (NMT), aan het elimineren van valse vectoren door middel van een vergelijking van elk naar de dichtstbijzijnde buren11. Collectief, hierdoor imaging om te worden uitgevoerd met apparatuur die gewoonlijk worden aangetroffen in veel bioengineering laboratoria, waardoor de noodzaak voor de verwerving van veel van de dure onderdelen van typische PIV-systemen (bijv., gepulste laser, de synchronisatieroutine cilindrische optica en private software). Nadere details betreffende de videocollectie beeldverwerking en de gegevensanalyse vindt u in de paragrafen 5 en 6 van het protocol.
Figuur 1 illustreert de PIV set-up gebruikt in dit protocol, die op een fluorescentie Microscoop uitgerust met een high-speed camera berust voor imaging, evenals een externe, continu wit-lichtbron (d.w.z., HQI-lamp) voor via-doelstelling volumetrische verlichting. Een veranderlijk-snelheid versnelling pomp wordt gebruikt om de recirculatie stroom van een oplossing van de transparante mock bloed via de neurovasculaire weefsel phantoms opleggen. De oplossing bestaat uit een 60:40 mengsel van gedeïoniseerd water (DI) en glycerol, die een gemeenschappelijk substituut voor bloed in hemodynamische12,13,14, wegens bestudeert een) zijn soortgelijke dichtheid en viscositeit (dat wil zeggen, 1.080 kg/m3 en 3.5 cP vs. 1.050 kg/m3 en 3-5 cP voor bloed)15,16; b) de transparantie in het zichtbare bereik; c) zijn soortgelijke brekingsindex als PDMS (1.38 vs. 1.42 voor PDMS)17,18,19,20, die minimaliseert van optische vervorming; d) het gemak waarmee niet-Newtoniaanse gedrag komen kan, indien nodig, via de toevoeging van xanthane21. Ten slotte, fluorescerende polystyreen parels worden gebruikt als tracer deeltjes (10.3 µm in diameter; 480 nm/501 nm excitatie/emissie). Terwijl neutraal drijfvermogen kralen gewenst zijn, kan sourcing tracer deeltjes met optimale vloeistof mechanische eigenschappen (zoalsdichtheid, grootte, samenstelling) en emissie golflengte uitdagende bewijzen. Bijvoorbeeld, zijn de kralen gebruikt hierin iets minder dicht dan de oplossing van glycerol (1.050 kg/m3 vs. 1.080 kg/m3). De hydrodynamische effecten, daarvan, zijn echter te verwaarlozen, gezien het feit dat de duur van een typisch experiment veel korter dan de tijdschaal drijfvermogen effecten gekoppeld is (dat wil zeggen, 5 min en 20 min, respectievelijk). Verdere details met betrekking tot de mock bloed oplossing formuleren en in vitro circulatory system set-up vindt u in de afdelingen 3 en 4 van het protocol.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol beschreven hierin schetst een vereenvoudigde methode voor het uitvoeren van PIV studies om te visualiseren neurovasculaire op fysiologisch relevante afmetingen en stroom voorwaarden in vitro stroomt. Daarbij, dient het ter aanvulling van de protocollen die zijn gemeld door anderen en die ook gericht hebben op het vereenvoudigen van de kwantificering van vectorvelden, maar in zeer verschillende contexten die vereisen dat de behandeling van veel grotere lengte schalen25 of lage…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen gedeeltelijke steun voor dit project geboden door een gezamenlijke zaad subsidie van het Bureau voor onderzoek en economischeontwikkeling op UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
Referências
- Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).
- Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9 (17), 2551 (2009).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
- Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).
- Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23 (11), (2013).
- Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).
- Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).
- Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).
- Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. . Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. , (2007).
- Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).
- Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).
- Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).
- Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).
- Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).
- Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).
- Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
- Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9 (12), 113762 (2014).
- Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505 (2012).
- Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285 (2000).
- Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).
- Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).
- Kuo, C. -. C., Mao, R. -. C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).
- Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12 (1), 014105 (2018).
- Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).
- Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).
- Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).
- Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).
- Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).
- Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).
- Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
- Tsai, W., Savaş, &. #. 2. 1. 4. ;. Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).
- Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).
