Meso-scala Particle Image Velocimetry studi di Neurovascular scorre In Vitro
Summary
Qui presentiamo metodi semplificati per fabbricare trasparente neurovascular fantasmi e caratterizzare il flusso in esso. Evidenziamo alcuni parametri importanti e dimostrare la loro relazione con la precisione del campo.
Abstract
Particle image velocimetry (PIV) viene utilizzato in un’ampia varietà di campi, a causa della opportunità che fornisce per appunto visualizzare e quantificare i flussi attraverso una vasta gamma di spazio-temporale. Tuttavia, la sua attuazione richiede in genere l’uso di strumentazione costosa e specializzata, che limita la sua utilità più ampio. Inoltre, all’interno del campo della bioingegneria, studi di visualizzazione del flusso in vitro anche spesso sono ulteriormente limitata dal costo elevato dei fantasmi di tessuto commercialmente provenienza che ricapitolano desiderati strutture anatomiche, in particolare per coloro che estendono il regime di mesoscala (cioè, submillimeter a scale di lunghezza di millimetro). Qui, presentiamo un protocollo semplificato sperimentale sviluppato per risolvere queste limitazioni, i cui elementi chiavi includono 1) un metodo relativamente a basso costo per la realizzazione di mesoscala fantasmi di tessuto mediante colata di silicone e stampa 3-d e 2) un quadro di analisi ed elaborazione immagine open source che riduce la domanda degli strumenti per la misurazione di flussi di mesoscala (cioè, velocità fino a decine di millimetri/secondo). Collettivamente, questo abbassa la barriera all’ingresso per nonexperts, sfruttando le risorse già a disposizione di molti ricercatori di bioingegneria. Abbiamo dimostrare applicabilità del presente protocollo nell’ambito della caratterizzazione di flusso neurovascular; Tuttavia, si prevede per essere rilevante per una vasta gamma di applicazioni di mesoscala in Bioingegneria e oltre.
Introduction
PIV è ampiamente usato in meccanica dei fluidi sperimentale per la visualizzazione del flusso e le indagini quantitative di movimento fluido che variano nella scala di lunghezza da atmosferico a flussi microcircolatoria1,2,3. Mentre le specifiche della sua attuazione possono variare ampiamente quanto le sue applicazioni, un aspetto comune a quasi tutti gli studi PIV è l’uso di formazione immagine dei video del tracciante particelle seminato all’interno del fluido di lavoro, seguito da un’analisi pairwise di fotogrammi consecutivi per estrarre le caratteristiche di portata desiderata. In genere, ciò avviene suddividendo ogni frame di immagine in regioni più piccole chiamate windows interrogatorio. In conseguenza le posizioni casuali delle particelle disperse, ogni finestra di interrogatorio contiene una distribuzione unica di intensità di pixel. Se la velocità di acquisizione di dati e dimensioni finestra vengono scelti in modo appropriato, cross-correlazione tra il segnale di intensità in ogni finestra consente di stimare lo spostamento medio all’interno di quella regione. Infine, dato che l’ingrandimento e il frame rate sono noti parametri sperimentali, un campo vettoriale di velocità istantanea può essere facilmente calcolato.
Il maggior vantaggio di PIV su tecniche di misura punto a punto è la sua capacità di mappare i campi di vettore in un dominio di due o tre dimensioni. Applicazioni di emodinamiche, in particolare, hanno beneficiato di questa capacità, poiché permette un’indagine approfondita dei flussi locali, che sono conosciuti per svolgere un ruolo significativo nella malattia vascolare o ristrutturazione (ad es., aterosclerosi, angiogenesi) 4 , 5 , 6. anche questo è stato vero per la valutazione dei flussi neurovascolari, e le interazioni dello stesso con dispositivi endovascolari (ad es., deviatori di flusso, stent, bobine intrasaccular), poiché le scale di lunghezza rilevante in tali applicazioni possono spesso occupare uno o più ordini di grandezza (ad es., dal micrometro al millimetro) e geometria del dispositivo e posizionamento possa influenzare notevolmente la meccanica dei fluidi locale7.
Maggior parte dei gruppi conducendo studi emodinamici basati su PIV hanno contato su set-up sperimentale che imitano molto attentamente alcune delle prime indagini di stent influenza il flusso vascolare7,8. In genere, questi includono un) pulsato laser e telecamere ad alta velocità, di catturare flussi ad alta velocità; b) sincronizzatori, per evitare l’aliasing tra la frequenza di impulso del laser e la frequenza di fotogrammi di acquisizione della fotocamera; c) ottica cilindrico, a formare un foglio leggero e, quindi, ridurre al minimo la fluorescenza di fondo da particelle di tracciante sopra e sotto il piano di interrogatorio; d) nel caso di sistemi commerciali chiavi in mano, pacchetti di software proprietario, per eseguire le analisi di correlazione incrociata. Tuttavia, mentre alcune applicazioni richiedono la prestazione e/o versatilità collettivamente offerto da questi componenti, molti altri non lo fanno. Dispone, inoltre, l’elevato costo del tessuto commercialmente provenienza fantasmi che ricapitolano desiderate strutture vascolari possono anche rivelarsi limitante per molti studi in vitro , particolarmente per fantasmi con quel ponte il regime di mesoscala (> 500 USD / Phantom). Qui, segnaliamo lo sviluppo di un protocollo semplificato per l’implementazione di PIV per la visualizzazione in vitro dei flussi neurovascolare, che in genere si trovano sia spazialmente e temporalmente all’interno del regime di mesoscala (cioè, scale di lunghezza che vanno da submillimeter al millimetro e velocità fino a decine di millimetri/secondo). Il protocollo mira a sfruttare le risorse già a disposizione di molti ricercatori di bioingegneria, abbassando così la barriera all’ingresso per nonexperts.
Il primo elemento di questo protocollo prevede l’utilizzo di una tecnica di colata di investimento per consentire la realizzazione di in-House di trasparente, polidimetilsilossano (PDMS)-base di fantasmi di tessuto da 3-D-stampati sacrificale stampi. Sfruttando la crescente disponibilità di stampanti 3-d negli ultimi anni, in particolare quelle condivise/multi-utente strutture (ad es., strutture istituzionali o pubblici makerspace), questa metodologia riduce i costi in modo significativo (ad esempio, < 100 USD/phantom nel caso presentato qui), consentendo una rapida inversione di tendenza per la fabbricazione di una vasta gamma di disegni e geometrie. Il protocollo attuale, una deposizione fusa sistema di modellazione è usata con acrilonitrile butadiene stirene (ABS) come il materiale da costruzione, in parte stampata funge da uno stampo sacrificale per la successiva fusione fantasma. La nostra esperienza ha dimostrato che l'ABS è particolarmente adatto per tale uso poiché è solubile in solventi comuni (ad es., acetone), e ha sufficiente forza e rigidità per mantenere l’integrità di muffa dopo la rimozione del materiale di supporto (ad es., a prevenire la deformazione o frattura del diminutivo mold caratteristiche). Nel protocollo attuale, muffa integrità ulteriormente è assicurata utilizzando modelli stampati solidi, anche se questo va a scapito del tempo di dissoluzione aumentata. L’uso di modelli hollow può anche essere possibile in alcuni casi, per promuovere l’accesso del solvente e così, ridurre il tempo di dissoluzione. Tuttavia, un’attenta considerazione dovrebbe essere data all’effetto questo può avere sull’integrità di muffa. Infine, mentre i fantasmi fabbricati nel presente documento si basano su rappresentazioni idealizzate di strutture neurovascular generate utilizzando un pacchetto di software (CAD) computer-aided design comune, il protocollo dovrebbe essere favorevole alla realizzazione di strutture più complesse , paziente-specifiche geometrie pure (per esempio, tramite l’utilizzo di file di modello generato dalla conversione di dati di imaging clinici per la. STL file formato utilizzato dalla maggior parte delle stampanti 3-d). Maggiori dettagli riguardo il processo di fabbricazione fantasma sono fornite nella sezione 2 del protocollo.
Il secondo elemento del protocollo prevede l’utilizzo di un plug-in per ImageJ per condurre l’ analisi cross-correlazione9open-source. Questo è accoppiato con l’attuazione di un regime di soglia statistica semplice (cioè, intensità tappatura)10 per migliorare il segnale di immagine prima del cross-correlazione, nonché uno schema di convalida postcorrelation vettoriale, la normalizzazione test della mediana (NMT), per eliminare spurie vettori attraverso un confronto di ciascuno ai suoi vicini di casa più vicina11. Collettivamente, questo consente di imaging essere eseguiti utilizzando apparecchiature che si trovano comunemente in molti laboratori di bioingegneria, eliminando così la necessità per l’acquisizione di molti dei componenti costosi di tipici sistemi PIV (ad es., laser pulsato, sincronizzatore, ottica cilindrica e software proprietario). Maggiori dettagli riguardo la raccolta video, elaborazione di immagini e analisi dei dati sono forniti nelle sezioni 5 e 6 del protocollo.
La figura 1 illustra il set-up PIV utilizzato nel presente protocollo, che si basa su un microscopio a fluorescenza equipaggiato con una telecamera ad alta velocità per l’imaging, nonché un esterno, fonte di luce bianca continua (cioè, lampada ad alogenuri metallici) per illuminazione volumetrica attraverso obiettivo. Una pompa a ingranaggi di velocità variabile viene utilizzata per imporre il flusso di ricircolo di una soluzione di sangue finto trasparente attraverso i fantasmi di tessuto neurovascolare. La soluzione è composta da una miscela di 60: 40 di deionizzata acqua (DI) e glicerolo, che è un sostituto comune per sangue in emodinamica studia12,13,14, dovuto un) sua simile densità e viscosità (vale a dire, 1.080 kg/m3 e 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 e 3-5 cP per sangue)15,16; b) la trasparenza nel campo visibile; c) il suo indice di rifrazione simile come PDMS (1,38 vs 1,42 per PDMS)17,18,19,20, che riduce al minimo la distorsione ottica; d) la facilità con cui possa essere introdotti il comportamento non-newtoniano, se necessario, tramite l’aggiunta di xantano21. Infine, perle di polistirolo fluorescenti vengono utilizzati come particelle di tracciante (10,3 µm di diametro; 480 nm/501 nm eccitazione/emissione). Mentre perle di galleggiamento neutro sono desiderati, particelle di tracciante con proprietà meccaniche ottimali fluido (ad esempio, densità, dimensione, composizione) e lunghezza d’onda di emissione di sourcing può rivelarsi difficile. Ad esempio, le perle utilizzate nel presente documento sono leggermente meno dense rispetto alla soluzione di glicerolo (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). Tuttavia, gli effetti idrodinamici, della stessa, sono trascurabili, dato che la durata di un tipico esperimento è molto più breve rispetto alla scala di tempo associata a effetti di galleggiabilità (cioè, 5 min e 20 min, rispettivamente). Ulteriori dettagli riguardanti l’assetto di sistema circolatorio sangue finto formulazione e in vitro di soluzione sono contenuti nelle sezioni 3 e 4 del protocollo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo descritto nel presente documento delinea un metodo semplificato per l’esecuzione di studi PIV per visualizzare neurovascular scorre fisiologicamente rilevanti dimensioni e flusso condizioni in vitro. In tal modo, serve a integrare protocolli riferiti da altri che si sono concentrati anche sulla semplificazione la quantificazione di campi vettoriali, ma all’interno di contesti molto diversi che richiedono che la considerazione di gran lunga più grande lunghezza scale25 o flu…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono supporto parziale per questo progetto fornito da una sovvenzione seme collaborativo l’ufficio di ricerca e sviluppo economico presso UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
Referências
- Grant, I. Particle image velocimetry: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part C: Journal of Mechanical Engineering Science. 211 (1), 55-76 (1997).
- Lindken, R., Rossi, M., Große, S., Westerweel, J. Micro-Particle Image Velocimetry (µPIV): Recent developments, applications, and guidelines. Lab on a Chip. 9 (17), 2551 (2009).
- Hove, J. R., et al. Intracardiac fluid forces are an essential epigenetic factor for embryonic cardiogenesis. Nature. 421, 172 (2003).
- Ando, J., Yamamoto, K. Vascular Mechanobiology. Circulation Journal. 73 (11), 1983-1992 (2009).
- Conway, D. E., et al. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Current Biology. 23 (11), (2013).
- Kuhlencordt, P. J., et al. Accelerated Atherosclerosis, Aortic Aneurysm Formation, and Ischemic Heart Disease in Apolipoprotein E/Endothelial Nitric Oxide Synthase Double-Knockout Mice. Circulation. 104 (4), 448-454 (2001).
- Lieber, B. B., Stancampiano, A. P., Wakhloo, A. K. Alteration of hemodynamics in aneurysm models by stenting: Influence of stent porosity. Annals of Biomedical Engineering. 25 (3), 460-469 (1997).
- Bulusu, K. V., Plesniak, M. W. Experimental Investigation of Secondary Flow Structures Downstream of a Model Type IV Stent Failure in a 180° Curved Artery Test Section. Journal of Visualized Experiments. (113), e51288 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Shavit, U., Lowe, R. J., Steinbuck, J. V. Intensity Capping: a simple method to improve cross-correlation PIV results. Experiments in Fluids. 42 (2), 225-240 (2007).
- Raffel, M., Willert, C. E., Werely, S., Kompenhans, J. . Particle Image Velocimetry: a Practical Guide. , (2007).
- Kerl, H. U., et al. Implantation of Pipeline Flow-Diverting Stents Reduces Aneurysm Inflow Without Relevantly Affecting Static Intra-aneurysmal Pressure. Neurosurgery. 74 (3), 321-334 (2014).
- Lieber, B. B., Livescu, V., Hopkins, L. N., Wakhloo, A. K. Particle Image Velocimetry Assessment of Stent Design Influence on Intra-Aneurysmal Flow. Annals of Biomedical Engineering. 30 (6), 768-777 (2002).
- Charonko, J., Karri, S., Schmieg, J., Prabhu, S., Vlachos, P. In vitro, time-resolved PIV comparison of the effect of stent design on wall shear stress. Annals of Biomedical Engineering. 37 (7), 1310-1321 (2009).
- Rand, P. W., Lacombe, E., Hunt, H. E., Austin, W. H. Viscosity of normal human blood under normothermic and hypothermic conditions. Journal of Applied Physiology. 19 (1), 117-122 (1964).
- Kenner, T., Leopold, H., Hinghofer-Szalkay, H. The continuous high-precision measurement of the density of flowing blood. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 370 (1), 25-29 (1977).
- Hoyt, L. F. New Table of the Refractive Index of Pure Glycerol at 20°C. Industrial & Engineering Chemistry. 26 (3), 329-332 (1934).
- Cai, Z., Qiu, W., Shao, G., Wang, W. A new fabrication method for all-PDMS waveguides. Sensors and Actuators A: Physical. 204, 44-47 (2013).
- Bouillot, P., et al. Particle imaging velocimetry evaluation of intracranial stents in sidewall aneurysm: hemodynamic transition related to the stent design. PloS ONE. 9 (12), 113762 (2014).
- Trager, A. L., Sadasivan, C., Lieber, B. B. Comparison of the in vitro hemodynamic performance of new flow diverters for bypass of brain aneurysms. Journal of Biomechanical Engineering. 134 (8), 084505 (2012).
- Clauser, J., et al. A Novel Plasma-Based Fluid for Particle Image Velocimetry (PIV): In-Vitro Feasibility Study of Flow Diverter Effects in Aneurysm Model. Annals of Biomedical Engineering. 46 (6), 841-848 (2018).
- Johnston, I. D., McCluskey, D. K., Tan, C. K. L., Tracey, M. C. Mechanical characterization of bulk Sylgard 184 for microfluidics and microengineering. Journal of Micromechanics and Microengineering. 24 (3), 035017 (2014).
- Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Analytical Chemistry. 75 (23), 6544-6554 (2003).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. A PIV Algorithm for Estimating Time-Averaged Velocity Fields. Journal of Fluids Engineering. 122 (2), 285 (2000).
- Bosbach, J., Kühn, M., Wagner, C., Raffel, M., Resagk, C. Large-Scale Particle Image Velocimetry of Natural and Mixed Convection. 13th Int Symp on Applications of Laser Techniques to Fluid Mechanics. , (2006).
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Santiago, J. G. PIV measurements of a microchannel flow. Experiments in Fluids. 27 (5), 414-419 (1999).
- Lima, R., et al. In vitro blood flow in a rectangular PDMS microchannel: experimental observations using a confocal micro-PIV system. Biomedical Microdevices. 10 (2), 153-167 (2008).
- Kuo, C. -. C., Mao, R. -. C. Development of a Precision Surface Polishing System for Parts Fabricated by Fused Deposition Modeling. Materials and Manufacturing Processes. 31 (8), 1113-1118 (2016).
- Kang, K., Oh, S., Yi, H., Han, S., Hwang, Y. Fabrication of truly 3D microfluidic channel using 3D-printed soluble mold. Biomicrofluidics. 12 (1), 014105 (2018).
- Prasad, A. K. Particle Image Velocimetry. Current Science. 79 (1), 51-60 (2000).
- Dellenback, P. A., Macharivilakathu, J., Pierce, S. R. Contrast-enhancement techniques for particle-image velocimetry. Applied Optics. 39 (32), 5978-5990 (2000).
- Cowen, E. A., Monismith, S. G. A hybrid digital particle tracking velocimetry technique. Experiments in Fluids. 22 (3), 199-211 (1997).
- Gruen, A. W. Adaptive least squares correlation: a powerful image matching technique. South African Journal of Photogrammetry, Remote Sensing and Cartography. 14 (3), 175-187 (1985).
- Nogueira, J., Lecuona, A., Rodríguez, P. A. Data validation, false vectors correction and derived magnitudes calculation on PIV data. Measurement Science and Technology. 8 (12), 1493-1501 (1997).
- Loudon, C., Tordesillas, A. The Use of the Dimensionless Womersley Number to Characterize the Unsteady Nature of Internal Flow. Journal of Theoretical Biology. 191 (1), 63-78 (1998).
- Drost, S., De Kruif, B. J., Newport, D. Arduino control of a pulsatile flow rig. Medical Engineering and Physics. 51, 67-71 (2017).
- Tsai, W., Savaş, &. #. 2. 1. 4. ;. Flow pumping system for physiological waveforms. Medical & Biological Engineering & Computing. 48 (2), 197-201 (2010).
- Kato, T., et al. Contrast-enhanced 2D cine phase MR angiography for measurement of basilar artery blood flow in posterior circulation ischemia. American Journal of Neuroradiology. 23 (8), 1346-1351 (2002).
