Meso-escala Particle Image Velocimetry estudos de Neurovascular flui em Vitro
Summary
Aqui nós apresentamos métodos simplificados para fabricar fantasmas neurovascular transparente e caracterizando o fluxo nele. Destaca-se vários parâmetros importantes e demonstrar sua relação com a precisão do campo.
Abstract
Velocimetria por imagem (PIV) é usada em uma ampla variedade de campos, devido a oportunidade que prevê precisamente Visualizar e quantificar os fluxos através de uma grande gama de spatiotemporal. No entanto, sua implementação geralmente requer o uso de instrumentação caro e especializado, o que limita sua utilidade mais ampla. Além disso, dentro do campo da bioengenharia, em vitro estudos de visualização de fluxo também são frequentemente mais limitado pelo alto custo dos espectros de tecido comercialmente origem que recapitular desejadas estruturas anatômicas, particularmente para aqueles que abrangem o regime de mesoescala (ou seja, submillimeter para escalas de comprimento milímetro). Neste documento, apresentamos um protocolo experimental simplificado desenvolvido para lidar com essas limitações, os elementos-chave dos quais incluem 1) um método de custo relativamente baixo para a fabricação de mesoescala espectros de tecido usando impressão 3-d e carcaça do silicone e 2) uma quadro de análise e processamento de imagem de código-fonte aberto que reduz a demanda sobre a instrumentação para medir os fluxos de mesoescala (ou seja, velocidades de até dezenas de milímetros/segundo). Coletivamente, isso diminui a barreira de entrada para nonexperts, aproveitando recursos já à disposição de muitos pesquisadores de bioengenharia. Nós demonstratethe aplicabilidade do presente protocolo no âmbito da caracterização do fluxo neurovascular; no entanto, espera-se que seja relevante para uma ampla gama de aplicações de mesoescala em Bioengenharia e além.
Introduction
PIV é amplamente utilizado na mecânica de fluidos experimental para a visualização fluxo e investigações quantitativas de movimentos fluidos que variam em escala de comprimento de atmosférico a fluxos microcirculatory1,2,3. Enquanto os detalhes de sua implementação podem variar tão amplamente como suas aplicações, um aspecto comum a quase todos os estudos PIV é o uso da imagem de vídeo de partículas de traçador semeado dentro do fluido de trabalho, seguido por uma análise por pares de quadros de imagens consecutivas para extrair as características de fluxo desejada. Normalmente, isso é realizado pela primeira subdividindo cada quadro de imagem em regiões menores denominadas janelas de interrogatório. Como consequência as posições aleatórias das partículas dispersas, cada janela de interrogatório contém uma única distribuição de intensidades de pixel. Se a taxa de aquisição de dados e tamanho de janela é escolhida apropriadamente, correlação cruzada do sinal de intensidade em cada janela pode ser usada para estimar o deslocamento médio dentro dessa região. Finalmente, dado que a ampliação e a taxa de quadros são conhecidos parâmetros experimentais, um campo vetorial de velocidade instantânea pode ser facilmente calculado.
Uma grande vantagem do PIV sobre técnicas de medição de ponto único é a sua capacidade para mapear campos vetoriais em um domínio de duas ou três dimensões. Aplicações de hemodinâmicas, em particular, se beneficiaram com esse recurso, uma vez que permite uma investigação minuciosa dos fluxos locais, que são conhecidas por desempenhar um papel significativo na doença vascular ou remodelação (por exemplo, aterosclerose, angiogênese) 4 , 5 , 6. isto também foi verdade para a avaliação dos fluxos neurovascular, e suas interações com dispositivos endovasculares (por exemplo, desviadores de fluxo, stents, bobinas de intrasaccular), desde os comprimento-escalas relevantes em tais aplicações podem muitas vezes abrangem uma ou mais ordens de grandeza (por exemplo, do micrômetro em milímetro) e geometria do dispositivo e colocação pode significativamente impactar o local mecânica dos fluidos7.
A maioria dos grupos de estudos baseados em PIV hemodinâmica têm invocado experimentais set-ups que intimamente imitam algumas das primeiras investigações de stent influência no fluxo vascular7,8. Normalmente, estes incluem um) pulsado lasers e câmeras de alta velocidade, para capturar os fluxos de alta velocidade; b) sincronizadores, para evitar serrilhado entre a frequência de pulso do laser e a taxa de quadros de aquisição de câmera; c) óptica cilíndrica, para formar uma folha de luz e, assim, minimizar a fluorescência de fundo de partículas marcador acima e abaixo do plano do interrogatório; d) no caso de sistemas comerciais de turn-key, pacotes de software proprietário, para realizar as análises de correlação cruzada. No entanto, embora alguns aplicativos exigem o desempenho e/ou versatilidade oferecidas coletivamente por estes componentes, muitos outros não o faz. Além disso, o alto custo do tecido comercialmente origem fantasmas que recapitular desejadas estruturas vasculares também podem provar limitantes para muitos estudos em vitro , particularmente para fantasmas com apresenta essa ponte o regime de mesoescala (> 500 USD / fantasma). Neste documento, nós relatamos o desenvolvimento de um protocolo simplificado pela execução PIV para a visualização em vitro de fluxos neurovascular, que normalmente estão ambos espacialmente e temporalmente dentro do regime de mesoescala (i.e., escalas de comprimento variando de submillimeter milímetros, e velocidades de até dezenas de milímetros/segundo). O protocolo visa alavancar recursos já à disposição de muitos pesquisadores de bioengenharia, diminuindo assim a barreira de entrada para nonexperts.
O primeiro elemento do presente protocolo envolve o uso de uma técnica de fundição de investimento para permitir a fabricação in-house de transparente, polidimetilsiloxano (PDMS)-com base em espectros de tecido de 3-D-impresso moldes sacrificiais. Aproveitando a crescente disponibilidade de impressoras 3-d nos últimos anos, particularmente aqueles em compartilhado/multi-usuário instalações (por exemplo, instalações institucionais ou makerspaces pública), esta metodologia corta custos significativamente (p. ex., < 100 USD/fantasma no caso apresentado aqui), permitindo uma rápida reviravolta para a fabricação de uma ampla variedade de projetos e geometrias. No protocolo atual, um depoimento fundido, sistema de modelagem é usado com acrilonitrila-butadieno-estireno (ABS) como o material de construção, e a parte impressa serve como um sacrifício molde para a fundição de fantasma subsequente. Nossa experiência tem mostrado que ABS é well-suited para tal uso, já que é solúvel em solventes comuns (por exemplo, acetona), e tem suficiente força e rigidez para manter a integridade do molde após a remoção do suporte material (por exemplo, para Evite a deformação ou fratura das características do molde diminutivo). No actual protocolo, integridade de molde é mais assegurada usando sólidos modelos impressos, embora isso vem à custa do tempo de dissolução de aumento. O uso de modelos ocos pode também ser possível em alguns casos, para melhorar o acesso de solvente e assim, reduzir o tempo de dissolução. No entanto, cuidadosa consideração deve ser dada ao efeito isto pode ter na integridade do molde. Finalmente, enquanto os phantoms fabricados neste documento são baseados em representações idealizadas de estruturas neurovasculares geradas usando um pacote de software de desenho assistido por computador (CAD) comum, o protocolo deverá ser favorável para a fabricação de mais complexo , geometrias específicas do paciente também (por exemplo, através do uso de arquivos de modelo gerado pela conversão de dados clínicos de imagem para o. Formato de arquivo STL usado pela maioria das impressoras 3-d). Para mais informações sobre o processo de fabricação fantasma são fornecidas na secção 2 do protocolo.
O segundo elemento do protocolo envolve o uso de um plug-in para ImageJ realizar as análises de correlação cruzada9abr-fonte. Este é acoplado com a implementação de um regime de limiarização estatística simples (ou seja, intensidade tampando)10 para melhorar o sinal de imagem antes da correlação cruzada, bem como um esquema de validação postcorrelation vector, o normalizado teste de mediana (NMT), para eliminar vetores espúrios, através de uma comparação de cada um de seus mais próximos vizinhos11. Coletivamente, isso permite que a imagem para ser realizado usando equipamentos comumente encontrado em muitos laboratórios de bioengenharia, eliminando assim a necessidade de aquisição de muitos dos componentes dos sistemas típicos de PIV (por exemplo, laser pulsado, caros sincronizador, óptica cilíndrica e software proprietário). Para mais informações sobre a coleção de vídeos, processamento de imagem e análise de dados são fornecidas nas seções 5 e 6 do protocolo.
A Figura 1 ilustra a afinação PIV, usada no presente protocolo, que depende de um microscópio de fluorescência, equipado com uma câmera de alta velocidade de imagem, bem como externo, fonte de luz branca contínua (ou seja, lâmpada de iodetos metálicos) para iluminação volumétrica através da objectiva. Uma bomba de engrenagem de velocidade variável é usada para impor o fluxo de recirculação de solução transparente sangue simulado através dos phantoms de tecido neurovascular. A solução é composta de uma mistura de 60: 40 de deionizada (DI) água e glicerol, que é um substituto comum para o sangue na hemodinâmica estuda12,13,14, devido a um) sua densidade e viscosidade (ou seja, semelhantes 1.080 kg/m3 e 3,5 cP vs 1.050 kg/m3 e 3-5 cP para o sangue)15,,16; b) sua transparência na faixa visível; c) o seu índice de refração similar como PDMS (1.38 vs 1,42 para PDMS)17,18,19,20, que minimiza a distorção óptica; d) a facilidade com que comportamento não-newtonianos pode ser introduzido, se necessário, através da adição de xanthane21. Finalmente, esferas de poliestireno fluorescentes são usadas como partículas traçador (10,3 µm de diâmetro; 480 nm/501 nm excitação/emissão). Enquanto neutra flutuantes grânulos são desejados, sourcing partículas traçador com óptimas propriedades mecânicas fluidas (por exemplo, densidade, tamanho, composição) e o comprimento de onda de emissão pode constituir um desafio. Por exemplo, os grânulos usados aqui são ligeiramente menos densos que a solução de glicerol (1.050 kg/m3 vs 1.080 kg/m3). No entanto, os efeitos hidrodinâmicos, dos mesmos, são negligenciáveis, dado que a duração de um experimento típico é muito menor do que a escala de tempo associada com efeitos de flutuabilidade (i.e., 5 min e 20 min, respectivamente). Mais detalhes sobre o sangue simulado solução formulação e in vitro sistema circulatório set-up são fornecidos nas seções 3 e 4 do protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui contornos de um método simplificado para a realização de estudos PIV para visualizar neurovascular flui em dimensões fisiologicamente relevantes e de condições de fluxo em vitro. Ao fazê-lo, serve para complementar protocolos relatados por outras pessoas que também têm focado simplificando a quantificação de campos vetoriais, mas dentro de contextos muito diferentes que exigem que a consideração de muito maior comprimento escalas de25 ou menor fluxo …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem suporte parcial para este projeto fornecido por uma concessão de semente colaborativo do escritório de pesquisa e desenvolvimento económico em UC Riverside.
Materials
| Solidworks 2015 | Dassault Systems | N/A | CAD Software |
| Dow Corning Sylgard 184 Kit | Ellsworth Adhesive | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | PDMS Kit |
| Stratasys Dimension Elite | Stratasys | 9180-00105 | 3D printer |
| P430 Model Material Cartridge | Stratasys | 340-21202 | ABS build material |
| P400 SR Soluble Support Material Cartridge | Stratasys | 340-30200 | Support material |
| CleanStation DT3 | PM3 Technologies | 00-00300R | Base bath |
| Lindberg Blue M LGO Box Furnace | Thermo Scientific | LB305745M | Oven |
| 21G BD PrecisionGlide Needle | Betcon Dickenson | BD 305167 | Branching perforator mold segment |
| Desiccator (Vacuum) | Polylab | 55205 | Desiccator |
| Branson 1800 Utrasonic Cleaning | Branson | CPX-952-116R | Sonicator |
| Acetone | Fisher Chemical | A9494 | Acetone |
| Isopropol Alcohol | Fisher Chemical | A4514 | Isopropol Alcohol |
| Glycerol | Fisher Chemical | GW33500 | Glycerol |
| 10um Polystyrene Yellow-Green Fluorescent Particles | Magsphere | PSF-010UM | Fluorescent beads |
| Phantom Miro | Vision Research | Miro M310 | High speed camera |
| Micropump | Cole-Parmer | 81101 | Recirculating pump |
| Leica DM2000 | Leica Microsystems | DM2000 | Fluorescent Microscope |
| Leica 10X Objective | Leica Microsystems | 506259 | Objective for perforator |
| Leica 2.5X Objective | Leica Microsystems | 11506083 | Objective aneurysm sac |
| Leica Blue Filter Cube L5 | Leica Microsystems | 513840 | Blue filter cube |
| Leica EL6000 | Leica Microsystems | 11504115 | Light source |
| Alconox | Alconox Inc | 1104-1 | Detergent |
| ImageJ | NIH | N/A | Open source image analysis software https://imagej.nih.gov/ij/ |
| Particle Image Velocimetry PIV Plugin | Qingson Tseng | N/A | https://sites.google.com/site/qingzongtseng/piv |
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