3D skanning teknologien bygge bro microcircuits og Macroscale hjerne profilen inne 3D romanen embedding overlappende protokollen
Summary
Denne artikkelen introduserer en eksperimentell protokoll ved hjelp av 3D-skanning teknologi som bygger bro over to romlige skalaer: den makroskopisk romlige skalaen av hele hjernen anatomi fotografert av MRI på > 100 μm og mikroskopisk romlig skala av neuronal distribusjoner ved hjelp av immunhistokjemi farging og en multielectrode array system og andre metoder (~ 10 μm).
Abstract
Den menneskelige hjerne, som er et multiscale system, har både makroskopisk elektriske signaler, globalt strømmer langs tykt hvitt-materie fiber bunter, og mikroskopiske neuronal pigger, spre langs axons og dendrites. Begge skalaer utfyller ulike aspekter av menneskelig kognitive og atferdsmessige funksjoner. På makroskopisk nivå har MRI vært den nåværende standard bildeteknologien, der den minste romlige oppløsningen, Voxel størrelsen, er 0,1 – 1 mm3. På mikroskopisk nivå var også tidligere fysiologiske studier klar over uniformt neuronal arkitekturer i slike voxels. Denne studien utvikler en effektiv måte å nøyaktig legge inn mikroskopiske data i et makroskopisk kart ved å grensesnitt biologisk vitenskapelig forskning med teknologiske fremskritt i 3D skanning teknologi. Siden 3D skanning teknologien har for største delen blitt anvendt for ingeniørvitenskap og industriell tegning til nå, det er en repurposed for det første gang å legge ned i microconnectomes inn i hele hjerne stund bevarer naturlig skyter inne lever hjerneceller. For å oppnå dette formålet, først, konstruerte vi en skanning protokoll for å få nøyaktige 3D-bilder fra levende bio-organismer iboende utfordrende å image på grunn av fuktige og reflekterende overflater. For det andre har vi trent til å holde hastigheten for å hindre nedbrytning av levende hjernevev, som er en nøkkelfaktor i å beholde bedre forhold og opptak mer naturlig neuronal pigger fra aktive neurons i hjernevevet. To kortikale overflate bilder, uavhengig Hentet fra to forskjellige Imaging moduler, nemlig MRI og 3D skanner overflaten bilder, overraskende viser en avstand feil på bare 50 μm som modus verdien av histogrammet. Denne nøyaktigheten er sammenlignbar i skala til mikroskopisk oppløsning av intercellulære avstander; Det er også stabilt blant forskjellige individuelle mus. Denne nye protokollen, 3D romanen embedding overlappende (3D-NEO) protokoll, broer makroskopisk og mikroskopiske nivåer avledet av denne integrerende protokollen og akselererer nye vitenskapelige funn for å studere omfattende tilkobling arkitekturer (dvs. microconnectome).
Introduction
Uniformt multiscale arkitekturer på ulike fysiske og biologiske organisasjoner er vanligvis funnet1,2. Hjernen er også en svært uniformt og multiscale nettverk organisasjon3,4. Ulike kognitive funksjoner er kodet i slike nettverk organisasjoner, holde timelige endringer av elektriske pigg mønstre av neuronal populasjoner i submillisecond timelige oppløsninger. Historisk, de komplekse nettverkene blant neurons ble strukturelt observert i detalj ved hjelp av farging teknikker av Santiago Ramón y Cajal fra over 150 år siden5. For å observere gruppe oppførsel av aktive neurons, har forskere utviklet ulike opptaks teknologier6,7,8, og den nylige betydelige utviklingen av slike teknologier har gjort oss i stand til å spille inn elektriske aktiviteter fra store antall neurons samtidig. Videre, fra slike funksjonelle aktiviteter, har forskere lyktes å rekonstruere nettverk av årsakssammenheng interaksjoner blant store antall neurons og har erklært den topologisk arkitekturen av deres komplekse interaksjoner ‘ microconnectome ‘9 . Makroskopisk observasjoner av hjernen også tillate for om en hel hjerne som en nettverksorganisasjon fordi mange hjernen regioner er forbundet med flere fiber-bunter. Innebygging av microconnectomes i den globale hjernen kartet har fortsatt klare begrensninger innen dagens teknologiske fremskritt, og det er derfor denne embedding protokollen er så viktig. Det er imidlertid mange utfordringer for utviklingen av innebygging protokollen. For eksempel, for å observere aktiviteter for å leve lokale neuronal kretser i rent isolerte hjerneområder, må hjerne skiver produseres for in vitro innspillinger. I tillegg er opptak fra hjerne skiver for in vitro-innspillinger fortsatt et viktig valg for minst to grunner. Først er det fortsatt ikke lett å observere aktiviteter av mange levende individuelle neurons samtidig fra hjernen regioner dypere enn ~ 1,5 mm og i høy Temporal oppløsning (< 1 MS). For det andre, når vi håper å vite den interne arkitekturen i en lokal neuronal krets, må vi stoppe alle innganger som kommer fra eksterne hjernen regioner for å eliminere forvirrende faktorer. For å identifisere retninger og posisjoner av produserte hjerne skiver, vil det være ytterligere nødvendig å integrere den romlige plasseringen av disse produserte hjerne skiver ved hjelp av koordinater. Det er imidlertid noen systematiske og pålitelige måter å lage hjerne skiver på en organisert måte10,11. Her introduseres en ny coregistration-protokoll ved hjelp av 3D-skannings teknologi for neuroscientific forskning for å gi en integrerende protokoll. Denne protokollen fungerer å koordinere mikro-og macroscales og legge multielectrode array (Mea) mikrodata12,13 og farging data på en makroskopisk MRI plass gjennom 3D Scan overflater av utpakkede hjerner, samt av invasivt registrert hjerner. Overraskende, dette viste en avstand feil på bare ~ 50 μm som modus verdien av histogrammet. Som følge av dette var modus verdiene for minimums avstander mellom to overflater mellom MRI-overflaten og den skannede 3D-overflaten nesten 50 μm for alle de seks musene, som er et passende tall når man ser etter felles blant enkeltpersoner. Den typiske skive bredde hadde en innspilt Spike aktivitet på rundt 300 μm.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi utviklet en ny protokoll kalt 3D-NEO-protokollen til å bygge bro over makroskopisk og mikroskopiske romlige vekter ved å overlappe to hjerne flater mer nøyaktig enn før. Opprinnelig var det to utfordringer i å skape denne protokollen som gjorde det mulig nøyaktig overlapping av to hjernen overflaten bilder og opptak sunne neuronal aktiviteter fra levende organismer. Først var det nødvendig å effektivt tørke kutte løsning rundt utdraget hjernen etter utpakking det fra skallen uten å skade hjernen organisme …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
M.S. er takknemlig for støtte fra alle de ansatte i medisinsk informasjon engineering kurs i Graduate School of Medicine og fakultet for medisin, og ønsker å takke Prof Tetsuya Takakuwa, Prof Huzioka Sawamoto, og Doris Zakian for deres hjelpsomme Kommentarer. Denne studien ble støttet av en Grant-in-Aid for utfordrende undersøkende forskning og av ledende initiativ for Excellent unge forskere (LEADER) program til M.S. fra MEXT (departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi). Mr eksperimenter i dette arbeidet ble utført i divisjonen for små dyr MRI, Medical Research Support Center, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Japan.
Materials
| Air compressor | Kimura Medical | KA-100 | Animal preparation for MRI |
| All-in-one fluorescence microscope | KEYENCE | BZ-X710 | |
| Anesthesia box | Bio Research Center | RIC-01 | Animal preparation for MRI |
| Anesthesia system | ACOMA Medical Industry | NS-5000A | Animal preparation for MRI |
| Anti-GAD67, clone 1G10.2 | Merk Millipore | MAB5406 | For immunostaining |
| Calcium Chrolide | nacalai tesque | 06729-55 | aCSF |
| Choline Chloride | nacalai tesque | 08809-45 | aCSF |
| curved blunt forceps | |||
| Disposal scalpel | Kai | 10 | |
| D-PBS(-) without Ca and Mg, liquid(10x) | nacalai tesque | For immunostaining | |
| D(+)-Glucose | Wako | 049-31165 | aCSF |
| Gelatin | nacalai tesque | 16605-42 | re-secctioning |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32723 | For immunostaining |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555 | Invitrogen | A32732 | For immunostaining |
| Heater mat | Bio Research Center | HM-10 | Animal preparation for MRI |
| Heater mat controller | Bio Research Center | BWT-100A | Animal preparation for MRI |
| Heater system | SA Instruments | MR-compatible Small Animal Heating System | Animal preparation for MRI |
| Isoflurane | AbbVie | Animal preparation for MRI | |
| Isoflurane vaporizer | ACOMA Medical Industry | MKIIIai | Animal preparation for MRI |
| Linear Slicer | DOSAKA | Neo Linear Slicer MT | |
| L(+)-Ascorbic Acid Sodium Salt | Wako | 196-01252 | aCSF |
| Magnesium Chrolide Hexahydrate | Wako | 135-00165 | aCSF |
| MaxOne Single-Well MEA | MaxWell Biosystems | ||
| Metal Spatula | |||
| Monitoring system | SA Instruments | Model 1025 | Animal preparation for MRI |
| Monitoring software | SA Instruments | PC-SAM V.5.12 | Animal preparation for MRI |
| MRI compatible cradle | Bruker BioSpin | T12812 | Animal preparation for MRI |
| MRI coil | Bruker BioSpin | T9988 | For MRI |
| MRI operation software | Bruker BioSpin | ParaVision 5.1 | For MRI |
| Neo LinearSlicer MT | D.S.K. | NLS-MT | |
| NeuN (D4G40) XP Rabbit mAb | Cell Signaling | 24307 | For immunostaining |
| Normal Goat Serum | Wako | 143-06561 | For immunostaining |
| Potassium Chloride | Wako | 163-03545 | aCSF |
| Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylphenyl Ether | nacalai tesque | 12967-45 | For immunostaining |
| Pressure-sensitive respiration sensor | SA Instruments | RS-301 | Animal preparation for MRI |
| Preclinical MRI scanner | Bruker BioSpin | BioSpec 70/20 USR | For MRI |
| Pyruvic Acid Sodium Salt | nacalai tesque | 29806-54 | aCSF |
| SCAN in a BOX | Open Technologies srl | ||
| scissors | |||
| Sieve bottle | TIGERCROWN | 81 | For 3D scan |
| SlowFade Gold Antifade Mountant | Invitrogen | S36937 | For immunostaining |
| Sodium Chloride | Wako | 191-01665 | aCSF |
| Sodium Dihydrogenphosphate | Wako | 197-09705 | aCSF |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Wako | 191-01305 | aCSF |
| Sodium Hydrogensulfite | nacalai tesque | 31220-15 | For immunostaining |
| Thermistor temperature probe | SA Instruments | RTP-101-B, PLTPC-300 | Animal preparation for MRI |
| Tooth bar | Bruker BioSpin | T10146 | Animal preparation for MRI |
| Winged intravenous needle | TERUMO | SV-23CLK | For perfusion |
| 1 mol/l-Tris-HCl Buffer Solution | nacalai tesque | 35436-01 | For immunostaining |
| 1 mol/l-Hydrochloric Acid | nacalai tesque | 37314-15 | For pH adjustment of solution |
| 16%-Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | For immunostaining |
Referências
- Vogelsberger, M., et al. Properties of galaxies reproduced by a hydrodynamic simulation. Nature. 509 (7499), 177-182 (2014).
- Zhang, B., et al. Integrated systems approach identifies genetic nodes and networks in late-onset Alzheimer’s disease. Cell. 153 (3), 707-720 (2013).
- Sporns, O., Chialvo, D. R., Kaiser, M., Hilgetag, C. C. Organization, development and function of complex brain networks. Trends in Cognitive Sciences. 8 (9), 418-425 (2004).
- Shimono, M. Non-uniformity of cell density and networks in the monkey brain. Scientific Reports. 3, 2541 (2013).
- DeFelipe, J., Jones, E. G. . Cajal on the Cerebral Cortex: An Annotated Translation of the Complete Wrings. , (1988).
- Kandel, E. R., Schwartz, J. H., Jessell, T. M. . Principles of Neural Science. , (2013).
- Pine, J., Taketani, M., Baudry, M. A history of MEA development. Advances in Network Electrophysiology. , 3-23 (2006).
- Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
- Shimono, M., Beggs, J. M. Functional clusters, hubs, and communities in the cortical microconnectome. Cerebral Cortex. 25 (10), 3743-3757 (2014).
- Amunts, K., et al. BigBrain: An Ultrahigh-Resolution 3D Human Brain Model. Science. 340, 1472-1475 (2013).
- Ali, S., et al. Rigid and non-rigid registration of polarized light imaging data for 3D reconstruction of the temporal lobe of the human brain at micrometer resolution. NeuroImage. 181, 235-251 (2018).
- Kozai, T. D. Y., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11, 1065-1073 (2012).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystems & Nanoengineering. 4 (1), 10 (2018).
- Hellwig, B. A quantitative analysis of the local connectivity between pyramidal neurons in layers 2/3 of the rat visual cortex. Biological Cybernetics. 82 (2), 111-121 (2000).
- Bezgin, G., Reid, A. T., Schubert, D., Kötter, R. Matching spatial with ontological brain regions using Java tools for visualization, database access, and integrated data analysis. Neuroinformatics. 7 (1), 7-22 (2009).
- Holmgren, C., Harkany, T., Svennenfors, B., Zilberter, Y. Pyramidal cell communication within local networks in layer 2/3 of rat neocortex. The Journal of Physiology. 551 (1), 139-153 (2003).
- Boucsein, C., Nawrot, M., Schnepel, P., Aertsen, A. Beyond the cortical column: abundance and physiology of horizontal connections imply a strong role for inputs from the surround. Frontiers in Neuroscience. 5 (32), 1-13 (2011).
- Edelsbrunner, H., Aronov, J. P. B., Basu, S., Sharir, M. Surface reconstruction by wrapping finite point sets in space. Discrete and Computational Geometry – The Goodman-Pollack Festschrift. , 379-404 (2003).
- Roland, P. E., et al. Human brain atlas: For high‐resolution functional and anatomical mapping. Human Brain Mapping. 1 (3), 173-184 (1994).
- Johnson, G. A., et al. Waxholm space: an image-based reference for coordinating mouse brain research. NeuroImage. 53 (2), 365-372 (2010).
- Evans, A. C., Janke, A. L., Collins, D. L., Baillet, S. Brain templates and atlases. NeuroImage. 62 (2), 911-922 (2012).
- Okabe, S. Brain/MINDS–a new program for comprehensive analyses of the brain. Microscopy. 64 (1), 3-4 (2015).
- Shimono, M., Hatano, N. Efficient communication dynamics on macro-connectome, and the propagation speed. Scientific Reports. 8 (1), 2510 (2018).
