Fast-understøttet, protein-fri, dobbelt phospholipid tolagede membraner (DLBM) kan omdannes til komplekse og dynamiske lipid nanorør netværk og kan tjene som 2D bottom-up modeller af det endoplasmatiske reticulum.
Vi præsenterer en praktisk metode til at danne en bottom-up strukturelle organelle model til det endoplasmatiske reticulum (ER). Modellen består af meget tætte lipidic nanorør, der er, i form af morfologi og dynamik, der minder om ER. Nettene er afledt af fosfolipid dobbelt tolagede membran patches fastholdelsen af en gennemsigtig Al2O3 substrat. Vedhæftning er medieret af Ca2 + i den omgivende buffer. Efterfølgende nedfiskning af Ca2 + gennem BAPTA/EDTA forårsager retraktion af membranen, hvilket resulterede i spontan lipid nanorør netværk dannelse. Metoden kun består af fosfolipider og microfabricated overflader for simple dannelsen af en ER model og kræver ikke tilsætning af proteiner eller kemisk energi (fx GTP eller ATP). I modsætning til 3D morfologi af det cellulære endoplasmatiske reticulum er modellen to-dimensionelle (omend nanorør dimensioner, geometri, struktur og dynamik bevares). Denne unikke i vitro ER model består af kun et par komponenter, er let at konstruere, og kan ses under et lysmikroskop. Den deraf følgende struktur kan være yderligere dekoreret for ekstra funktionalitet, såsom tilføjelsen af ER-associeret proteiner eller partikler at studere transport fænomener blandt rør. De kunstige net beskrevet her er passende strukturelle modeller for cellulær ER, hvis unikke karakteristiske morfologi har vist sig at være relateret til dens biologiske funktion, mens detaljer om dannelsen af domænet rørformede og rearrangementer inden for er stadig ikke helt forstået. Vi bemærke, at denne metode bruger Al2O3 tynd-film-belagt mikroskopi coverslips, som fås i handelen, men kræver særlige ordrer. Derfor er det tilrådeligt at have adgang til en microfabrication facilitet til forberedelse.
Skadestuen udfører afgørende opgaver i cellen biologiske herunder proteinfoldning, lipid syntese og calcium forordning1,2. ER morfologi er iboende de funktion, den udfører. Det kombinerer planar stakke og tætte-dynamisk rørformede domæner, som løbende interagere med cytoskelettet og undergår konstant bevægelse og omlægning. Nogle af de ombygninger, ER strukturer gennemgår omfatter den løbende transformation mellem Plane plader og rør, vesikel dannelsen fra eller fusion ER lumen, forlængelse af allerede eksisterende rør, rør retraktion, fusion og brud3. De rørformede net ejendommelig struktur er energisk ugunstig. Veje og mekanismer, som på Skadestuen genererer og vedligeholder denne organisation såvel som, hvor det drejer sig om dens funktion ikke er endnu forstået fuldt ud4,5.
Det er kendt, at Skadestuen funktionsfejl når det mister sin homeostatiske tilstand, hvilket resulterer i ER stress, en tilstand forårsaget af en stigning i proteinsyntesen, ophobning af fejlfoldede proteiner eller ændringer i Ca2 + og oxidative balance. ØH forårsager stress igen deformering af den naturlige morfologi af organelle, specielt ved at forstyrre netværk organisation6,7. Som en reaktion aktiveres cellen en reparation mekanisme til at vende tilbage til En homeostatiske tilstand. Svigt i reparation kan føre til ER-induceret celle apoptose, som bidrager til flere metaboliske og degenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom, type 2 diabetes, Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose og flere andre7, 8. Aktuel forskning rettet mod tilrettelæggelse af de rørformede ER net, og flere undersøgelser fokuserer på erstatningsgodtgørelse ER in vitro-2. Et par eksisterende modeller2,9,10 kræver proteiner til at igangsætte og opretholde membran krumning3,11 og hjælpe organelle nå sin form. Klart, modelsystemer, der afspejler nogle af de vigtigste strukturelle og organisatoriske funktioner i Skadestuen og giver adgang til avancerede eksperimentelle undersøgelser er i stor efterspørgsel.
Vi præsenterer her procedurer for udarbejdelse af en letkøbt, protein/kemisk energi-fri, dynamisk i vitro model til Skadestuen, giver en grundlæggende platform for at studere ER morfologi og tilknyttede funktioner4. I denne metode, er en ER model fremstillet med en bottom-up tilgang ved hjælp af kun et par elementer, hvori molekyler af interesse kan integreres for at tilføje kompleksitet. Netværket repræsenterer ER struktur og dynamik. Derudover reversible transformation mellem planar membranen og rør, vesikel dannelsen fra rør, tube fusion, glidende og sammentrækning kan alle overholdes. Foruden tjener som en bottom-up-model til utilstrækkeligt forstået cellulære Skadestuen, kan ruten lipid nanorør net i denne protokol beskrevne være relevant for forskere studerer samlesæt, nanofluidics, enkelt-molekyle og kolloid transport fænomener, Marangoni flow, og andre relaterede felter. Kun molekylære byggesten bruges i vores metode er fosfolipider. Protokollen kræver lidt laboratoriearbejde og grundlæggende udstyr og er tilgængelig til indbygning af supplerende elementer.
I den følgende diskussion, er kritiske trin, eventuelle ændringer og begrænsninger af protokollen beskrevet. Det første vigtige skridt er ordentlig samling af salen observation, da vedhæftning af PDMS rammen til Al2O3 overflade er uløseligt svag. I tilfælde hvor rammen ikke overholder underlaget korrekt, indholdet vil lække fra observation kammer og eksperimentet vil komme til at stå. De vigtigste faktorer, der hindrer korrekt forsegling af overflade og ramme 1) en mangel på grundig rengøring af rammen (genbruges) PDMS og 2) luft bobler, der lejlighedsvis få fanget mellem ramme og underlag. En nypræparerede eller grundigt rengjort PDMS ramme bør anvendes. Rammen bør skylles før og efter hver brug med isopropanol, efterfulgt af skylning med Deioniseret vand og føntørring med kvælstof. Al2O3 flader kræver ikke nogen forudgående rengøring, da de er fremstillet i et renrum miljø og opbevares i lukkede beholdere indtil brug. På grund af Al2O3amfotere karakter, bør det ikke blive udsat for stærkt sure opløsninger. Andre mønstre for observation kammer kan være ansat, afhængigt af tilgængeligheden af den individuelle opsætning. Vigtige funktioner i salen er gratis adgang til den flydende prøve fra den åbne top og inaktive ramme materiale med hensyn til de anvendte løsninger og prøver. Dimensionerne kammer er også en væsentlig faktor, som de skal rumme en diskenhed fra 0,5 til 1 mL. Da overflader anvendes typisk standard-størrelse coverslips (24 x 60 mm), bestemmes mængden af salen hovedsagelig af tykkelsen af rammen. Til vores viden er afstandsstykker med størrelse og dybde, som kan rumme de prøve mængder typisk håndteres i denne protokol ikke kommercielt tilgængelige. Vi har derfor dedikeret en sektion i protokollen detaljer af fremstilling og montage af en prøve salen ramme.
Den anden afgørende skridt i denne protokol er buffer udvekslingen. En udfordring i dette trin er timingen kræves for at udføre denne udveksling. Spredning af MLV ved kontakt med Al2O3 substrat er instant, og den fortsatte udvidelse af DLBM fører til sin brud, afslutter eksperimentet (figur 2A, B). Derfor spredning bør overvåges konstant, og buffer udveksling skal udføres i tide. Udveksling bør ikke udføres for hurtigt efter initialisering af spredning, således at membran patches til at nå en optimal størrelse (100-200 µm i diameter). På den anden side forårsager løbende vedhæftning på overfladen høj membran spændinger, der fører til brud. Således patches alle membran til sidst brud hvis spredning ikke er afbrudt. Timingen af den brud er forskellig for hver patch, da det afhænger af størrelse og interne struktur af MLV og tilgængelighed af lipider deri. Tidspunktet for udveksling bør derfor arrangeres til et tidspunkt, hvor de un-bristet pletter med optimal størrelser repræsenterer et flertal af hele befolkningen. En anden udfordring i buffer exchange trin er satsen af fjernelse og tilføjelse af buffere. Udfører denne substitution for hurtigt har en skadelig indflydelse på de endelige membran strukturer (figur 2C-E). Overdreven udvinding af Ca2 +– HEPES buffer uden at forlade en tyndt flydende film på bærematerialet, resulterer i tørrede og uigenkaldeligt deforme membran patches (figur 2C). Selv om en ordentlig mængde væske er opretholdt på overfladen, forårsager pludselige tilsætning af Chelator-HEPES buffer også undertrykkelse af netbårne membran strukturer. Figur 2 D,E viser den typiske udseende af hydrodynamically forstyrret membran patches. Den samlede morfologiske forstyrrelser påvirker ikke nødvendigvis de dynamiske egenskaber af de endelige strukturer (dvs. de rørformede rearrangementer i resterende områder vil stadig forekomme). Dog vil det blive vanskeligt at observere den materielle transformation på de deforme strukturer. For eksempel, i figur 2D, ville det være vanskeligt at bestemme den retning, som MLV DLBM trækker sig tilbage.
En mulig ændring af protokollen er lipid sammensætning bruges. Hovedfokus har været på fosfolipider, der dominerer ER sammensætningen i pattedyr og gær16 (e. g., phosphatidylcholin (PC), phosphatidylethanolamin (PE), og phosphatidylinositol (PI). De oprindelige eksperimenter blev udført ved brug af PC og PI blandinger4. I resultaterne præsenteres, blev en blanding af PC og DOPE og et derivat af PE brugt. Dog er ikke alle vilkårlige lipid kompositioner blevet fundet for at skabe de rørformede strukturer fremkommer gennem denne protokol. Et par af de andre eksperimentelt undersøgte lipid blandinger indebærer samlede hjerte ekstrakt, soy bean uddrag polar, E. coli ekstrakt polar, blandinger af PC med stearoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoinositol (Lyso-PI) i varierende forhold og blandinger af PC-PE-PI-Posphatidyl Serin (PS) i varierende forhold. Eftersom rørformede membran strukturer besidder høje krumninger og kræver særlig ordning af individuelle lipid molekyler, forventes det, at det observerede fænomen er lipid sammensætning-specifikke.
En anden ændring anvendes i denne protokol er metoden til overflade fabrikation. Her, blev ALD brugt til at fabrikere Al2O3 belagt coverslips. Dette adskiller sig fra den oprindeligt rapporterede deposition metode, reaktiv sputtering4. Mens dette indikerer, at en alternativ overflade fabrikationsanlæg metode stadig kan føre til ER-lignende tubulation, synes en vigtig begrænsning at være specificiteten af den overflademateriale. Mode af spredning og styrke af vedhæftning er meget afhængig af overflademateriale, egenskaber, der påvirker faktorer såsom elektrostatiske interaktion, Fugtningsmuligheden, hydrophobicity og ruhed af overfladen. Al2O3 overflader give optimal vedhæftning styrke, og lipid film kan både vedhæfte kraftigt nok til at sprede som en dobbelt lipid tolagede membran og frigøre at danne rørformede netværk efter udtagning af Ca2 + ioner. Vi har tidligere testet det samme eksperiment med SiO2, hvori de multilamellar vesikler spredes som en dobbelt lipid tolagede membran, men ingen rørformede netværk dannelse blev observeret ved tilsætning af chelatorer17. Nedtrapning udlæg og tube dannelse er observeret kun på Al2O3 eller plasma ætset Al18. Vores undersøgelser afslørede, at parameteren medvirkende fører til sådant fænomen var zeta potentielle af overflader, som Al og Al2O3 var tæt på nul (mV) og SiO2 betydeligt negativt. Zeta potentiale af borosilicate er magen til SiO219; vedhæftning af lipid film på borosilicate er derfor lige så stærk og irreversibel. Faktisk fører multilamellar lipid reservoir kontakt til borosilicate overflader typisk til øjeblikkelig brud og dannelsen af enkelt lipid dobbeltlag20. Al2O3 overflader kræves for denne protokol er ikke let eller kommercielt tilgængelige. De kan dog custom-bestilt fra specialty glas og substrat producenter. Adgang til renrum faciliteter med tynd-hinde fabrikation udstyr er stærkt anbefales.
De andre eksisterende bottom-up metoder til at fabrikere ER-lignende rørformede netværk2,10 involverer proteiner samt input af kemisk energi (fx., GTP og ATP). Rapoport og kolleger2 rapporteret dannelsen af ER-netværk på glas coverslips i vitro ved at blande de membran-bøjning proteiner øjeblikket i ER, med fosfolipider og GTP. Arbejde af Bachand et al. 10 viser, hvordan sådanne dynamiske rørformede netværk kan oprettes ved hjælp af molekylære motorer og ATP som energikilde. Denne protokol fremlagde kræver ikke Membranproteiner eller hydrolyse af organiske forbindelser til energi. De kun væsentlige komponenter er fast substrat og Fosfolipiderne. Rensning og udvinding af proteiner er ikke påkrævet. Denne protokol giver i form af enkelheden i de konstituerende molekyler, de mest grundlæggende ER model.
Med denne grundlæggende, lipid-baserede ER model etableret, er opbygningen af kompleksiteten ved at tilføje ER tilknyttet komponenter af interesse, da det giver mulighed for undersøgelse af enkelte påvirkninger på systemet. Svarende til de faktiske ER net, rør i modellen er dynamisk. Konjugation til og migration af mærket Membranproteiner eller fluorescerende partikler i hele den rørformede netværk, kan give oplysninger om retningen af membran bevægelse. Indkapsling og overvågning af fluorescerende væske inde i DLBM og rør under transformation og en eventuel kortlægning af intratubular indhold transport kan tjene som et andet fokus. Endelig, en overgang fra den 2D ER model som følge af denne protokol mod en 3D glat ER model kan vedtages gennem indkapsling af netværk i hydrogel arkitekturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Aldo Jesorka fra Chalmers University of Technology i Sverige for hans uvurderlige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev muliggjort gennem økonomisk støtte fra forskning Rådet af Norge (Forskningsrådet) Project Grant 274433, UiO: Life Sciences konvergens miljø, svenske Forskningsråd (Vetenskapsrådet) Project Grant 2015-04561, samt opstart finansiering, som Center for Molekylær medicin Norge & fakultetet for matematik og naturvidenskab ved universitetet i Oslo.
Pear-shape flask 10 mL | Lenz Laborglasinstrumente | 3.0314.13 | In which the lipid mixture is prepared |
Hamilton 5 mL glass syringe (P/N) | Hamilton | P/N81520 | For transfer of the chloroform to beaker |
Custom large hub needle Gauge 22 S | Hamilton | 7748-18 | Removable needle for syringe specified in row 3 |
Hamilton 250 µL glass syringe | Hamilton | 7639-01 | Used for transfer of lipids in chloroform to the flask |
Large hub Gauge 22 S | Hamilton | 7780-03 | Removable needle for syringe specified in row 5 |
Hamilton 50 µL glass syringe | Hamilton | 7637-01 | Used for transfer of fluorophore-conjugated lipids to the flask |
Small hub Gauge 22 S | Hamilton | 7770-01 | Removable needle for syringe specified in row 7 |
Chloroform anhydrous (≥99%) | Sigma-Aldrich | 288306 | Used to complete the lipid mixture to a total of 300 µL |
Soy L-α Phosphatidyl choline lipid (Soy PC) | Avanti Polar Lipids Inc | 441601 | phospholipid species contributing to 69% of the total composition/mixture |
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids Inc | 850725 | phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture |
L-α Phosphatidyl inositol lipid (Soy PI) | Avanti Polar Lipids Inc | 840044 | alterative phospholipid species contributing to 30% of the lipid composition/mixture (from the original article Bilal and Gözen, Biomaterials Science, 2017) |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine,triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific) | T1395MP | Fluorescent-lipid conjugate, 1% of the lipid composition/mixture |
Digital Dry Baths/Block Heaters | Thermo Fischer | 88870006 | To warm glycerol in order to decrease its viscosity |
Glycerol for molecular biology (≥99%) | Sigma Life Science | G5516 | For lipid preparation |
PBS buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 17-21 | Used to prepare the lipid suspension | ||
TRIZMA base, primary standard and buffer (≥99%) | Sigma Life Science | T1503 | Used to prepare PBS buffer |
Potassium phosphate tribasic, reagent grade (≥98%) (K3PO4) | Sigma-Aldrich | P5629 | PBS buffer ingredient |
Magnesium sulfate heptahydrate, BioUltra (≥99,5%) KT (MgSO47H2O) | Sigma Life Science | 63138 | PBS buffer ingredient |
Potassium phosphate monobasic, anhydrous, free flowing, Redi-Dri, ACS (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 795488 | PBS buffer ingredient |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate ACS reagent, 99.0-101.0% (Na2EDTA) | Sigma-Aldrich | E4884 | PBS and Chelator-HEPES buffer ingredient |
Ultrasonic cleaner USC-TH | VWR | 142-0084 | Ultrasonication of rehydrated lipids |
Rotary evaporator - Büchi rotary evaporator Model R-200 | Sigma | Z626797 | For evaporation of chloroform |
Pressure meter – Vacuum regulator IRV-100 | SMC | IRV10/20 | For controlling the pressure value during lipid dehydration |
HEPES-buffer (pH=7.8); ingredients below in rows 26-27 | Used for rehydration of lipids. Content: 10 mM HEPES with 100 m NaCl diluted in ultrapure deionized water | ||
HEPES ≥99.5% (titration) | Sigma Life Science | H3375 | HEPES-buffer ingredient |
Sodium chloride for molecular biology, DNase, RNase, and protease, none detected, ≥98% (titration) (NaCl) | Sigma Life Science | S3014 | HEPES-buffer ingredient |
Calcium-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 29 | Used for spreading of lipids. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 4 mM CaCl2 diluted in ultrapure deionized water | ||
Calcium chloride anhydrous, BioReagent, suitable for insect cell culture, suitable for plant cell culture, ≥96.0% (CaCl2) | Sigma Life Science | C5670 | To prepare Calcium-HEPES buffer |
Chelator-HEPES buffer (pH=7.8); effective ingredient below in row 31 | Used to promote the formation of tubular networks. Content: 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA and 7 mM BAPTA diluted in ultrapure deionized water | ||
1,2-Bis(2-aminophenoxy)ethane-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt ≥95% (HPLC) (BAPTA-Na4) | Sigma Life Science | 14513 | Chelator-HEPES buffer ingredient |
Sodium Hydroxide | Sigma | 30620 | Basic solution used to adjust the pH of the buffers |
pH meter accumet™ AE150 pH | Fisher Scientific | 1544693 | Used to measure the pH of all buffers |
Glass petri dish | VWR | HECH41042012 | 6 cm, used for making the PDMS sheet |
Potassium hydroxide ACS reagent, ≥85%, pellets (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | To make the KOH solution for cleaning glass petri dish for the fabrication of the PDMS sheet |
Isopropanol prima ren 99.5% | Antibac AS | 600079 | KOH solution ingredient |
Heating and drying oven – venticell | MMM Medcenter Einrichtungen GmbH | MC000714 | For drying of the glass petri dish after silanization and to cure PDMS |
Dichlorodimethylsilane ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 440272 | Used for silanization of glass petri dish in which PDMS sheet is prepared |
Vacuum pump | Cole-Parmer | EW-79202-05 | Connected to desiccator |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow corning | 24236-10 | Kit to make PDMS solution |
Sylgard 184 Silicone elastomer base | |||
Disposable scalpel | Swann-Morton | 11798343 | Used to cut the PDMS |
Cover slips | Menzel -Gläser | MEZ102460 | 24×60 mm. Used to deposit thin film of Al2O3 |
Atomic layer deposition system | Beneq | TFS200 (model number) | Atomic Layer deposition system used to deposit thin film of Al2O3 in microscope cover glass |
Ellipsometer | J.A. Woollan Co. | Alpha-SE (model name) | System used to charcaterize the thickness of the film deposited on glass surface |
Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | Microscope used for visualization of the experiment |
Objective 40x, 1.3 NA | Leica Microsystems | 1550635 | Used for visualization of the experiment |
White light laser source | Leica Microsystems | Leica TCS SP8 X | For excitation of the membrane fluorophore |