Våt-spinning-baserade gjutprocessen av Gelatin för vävnadsregeneration
Summary
Vi utvecklade och beskriva ett protokoll baserat på begreppet våta spinning, för byggandet av gelatin-baserade biomaterial som används för tillämpningen av vävnadsteknik.
Abstract
Denna artikel presenterar en billig metod för att fabricera gelatin, som en naturlig polymer, i monofilament fibrer eller annan lämplig form. Genom den våta spinning metod, tillverkas gelatin fibrer av slät extrudering i en lämplig koagulering medium. För att öka den funktionella ytan av dessa gelatin fibrer och deras förmåga att härma funktionerna i vävnader, kan gelatin formas i en tub form genom att hänvisa till detta begrepp. Granskas av in vitro- och in vivo tester, visar gelatin rören stor potential för tillämpning i vävnadsteknik. Egenskap av lämplig lucka fyllnadsmaterial, gelatin rör kan användas för att ersätta vävnaden i det skadade området (t.ex. i nervös eller kardiovaskulära systemet), samt för att främja regenerering genom att tillhandahålla en direkt ersättning av stamceller och neurala kretsar. Detta protokoll innehåller detaljerade anvisningar för att skapa ett biomaterial baserat på en naturlig polymer, och dess genomförande förväntas till stor nytta för utvecklingen av korrelat naturliga polymerer, som bidra till att förverkliga strategier för regenerering av vävnad.
Introduction
Den senaste utvecklingen i vävnadsregenerering innebär att tillämpningen av vävnadsteknik, som utgör en utmaning för förbättring av nya terapeutiska strategier i medicinska behandlingar. Till exempel utgör begränsad potential av nervsystemet regenerering, följande skada eller sjukdom, ett betydande hälsoproblem över hela världen. På grund av komplexiteten i patofysiologiska processer som är associerade med nervsystemet, användning av traditionella autograft eller genomförandet av stabilisering kirurgi har visat sig erbjuda fördelar i funktionella resultat, men det finns inga starka bevis för effekterna av spinal fixering kirurgi1,2. Vävnaden på det skadade området är förlorat och ersättas med hypertrophically inducerad astrocyter3, så småningom bilda en tät gliaceller ärr4,5. Denna matris fungerar som en barriär att block återvinning av nerv funktion6,7 och är således avsevärt hindrar regenerering. Därför lämpligt gap fyllnadsmaterial förväntas förhindra förlust av vävnad och minska bildningen av ärr-associerade bindväv genom att upprätthålla integriteten i det skadade området, samt genom att ge direkt ersättning av neurala celler och kretsar att främja axon regenerering.
Polymera biomaterial har föredragits som ställningar för vävnad förnyelse terapi, baserat på regleringen av cell eller axon beteende och vävnad progression genom naturliga extracellulär matrix (ECM) stöd. Formatet fiber anses vanligen som en byggsten för olika material, på grund av dess endimensionella struktur8. Fibrerna kan i allmänhet erhållas genom smälta extrudering eller våt spinning metod; men är storleken och kostnaden för utrustningen och det är svårighet att utföra dessa metoder utmanande. Dessutom har majoriteten av det arbete som relaterade till polymer fibrer fokuserat på syntetiska eller komposit material. Naturliga polymerer som en källa av biomaterial erbjuda bättre biokompatibilitet egenskaper för den mänskliga kroppen. Är dock relativt svårare än av syntetisk polymer källor9för att få anpassningen av naturlig polymer fibrer. Omvandling av en naturlig polymer som en rik källa av protein till biomaterial fibrer är därför en viktig strategi — inte bara kan biomaterial fibrerna vara direkt isolerad från råvaran, därmed undvika en onödig omvandling till monomerer, men den protein fibrer har också en bra utseende och goda egenskaper10.
I detta sammanhang beskriver vi en billig bearbetningsmetod för tillverkning av naturlig polymer fibrer genom grundläggande begreppet våta spinning, som kan genomföras på laboratorieskala för vävnadsteknik. Våta spinning utförs av extrudering och koagulering av en polymer lösning till en lämplig polymer nonsolvent. En lämplig, viskös lösning dopade till koagulering medium orsakar polymermolekylerna att upplösa. Genom fas övergången, filament sedan förlora deras löslighet och fälls ut i form av en fast polymer fas11. Hänvisning till detta begrepp, utökade vi sedan utvecklingen av gelatin till formuläret tube av en molding process, som anses lämplig för vävnad förnyelse program. Dessutom intimt, kan vi också utveckla någon form av material från gelatin fibrer (t.ex. gelatin conduit rullas upp från flera gelatin fibrer), för andra önskat program.
Gelatin, en biologiskt nedbrytbar naturlig polymer, bildas från denaturerad och hydrolyserat kollagen, inklusive alla semicrystalline, amorft eller trippel spiralformade tillstånd av kollagen12. Det är väl känt att kollagen är det väsentliga strukturella proteinet i alla bindväv ryggradsdjur och ryggradslösa djur13,14, som liknar proteinstruktur huvudsakliga ECM som inducerar nerv tillväxt och, samtidigt, ersätter en stor mängd glykosaminoglykan utsöndras under ryggmärgsskador. Därför, användningen av gelatin som en källa skulle vara ett utmärkt val för alla medicinska fordon. Förutom att vara en billig källa, gelatin är också biologiskt nedbrytbara och cytocompatible och kliniskt visat sig vara en temporär defekt filler15. Utvecklats till en tub form, Visa in vitro- och in vivo tester som beskrivs här att gelatin har en utmärkt biokompatibilitet och lämplighet för framtida vävnad tekniska tillämpningar. Odlade med mänskliga fett stamceller, gelatin rör förbättra celldifferentiering i neurala stamceller med positiva nestin färgning som neurala cell markör. Dessutom förväntas gelatin som gap fyllnadsmaterial, som produceras av den metod som fastställts i denna studie vara lätthanterligt och säkert och till stor nytta för vävnad ingenjörer som utvecklar för närvarande korrelat naturliga polymerer för förstärkningen av vävnad strategier för förnyelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi presenterade utvecklingen av gelatin-baserade biomaterial med hjälp av en enkel våt spinning teknik som kan tillämpas i studien av naturliga polymerer för vävnadsregeneration. Detta arbete visade möjligheten att gelatin tillverkning som en bra proteinkälla utan tillsats av andra källor, i syfte att optimera egenskaperna för gelatin själv. Utvecklingen av gelatin-baserade biomaterial genomfördes helt i rumstemperatur (22-26 ° C). En skonsam lösning beredning är ett kritiskt steg i protokollet, som är att…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av nationella försvarsdepartementet (MAB-105-070; MAB-106-077; MAB-107-032; MAB-107-065), ministeriet för vetenskap och teknik (de flesta 107-2320-B016-016), Tri-Service General Hospital, nationella försvar vårdcentral, Taiwan (TSGH-c‑106-046; TSGH-C‑106-115; TSGH-C107-041), och Cheng-Hsin General Hospital och National Defense Medical Center samarbete (CH-NDMC-107-8).
Materials
| Solution preparation: | |||
| Gelatin type B (porcine) | Ferak | Art. -Nr. 10733 | 500 g vial |
| Wet spinning process: | |||
| Peristaltic pump | Gilson | Model M312 | Minipuls*3 |
| Plastic tube connector | World Precision Instruments | 14011 | 1 box |
| Syringe | Sterican | 5A06258541 | 26Gx1/2"(0.45 x 12mm) |
| Acetone | Ferak | Art. -Nr. 00010 | 2.5 L vial |
| Polycaprolactone CAPA 6500 | Perstorp | 24980-41-4 | – |
| Dichloromethane | Scharlau | CL03421000 | 1 L vial |
| Glass Pasteur pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | – |
| Hemostat | Shinetec instruments | ST-B021 | – |
| Peripheral venous catheter (Introcan Certo) | B. Braun | 1B03258241 | 24Gx3/4"(0.7 x 19mm) |
| Morphology of the gelatin tube: | |||
| Ion sputter coater machine | Hitachi | e1010 | – |
| Scanning electron microscopy | Hitachi | S-3000N | – |
| Cultivation of cells on the gelatin tube: | |||
| Trypsin-EDTA | Gibco | 488625 | 100 mL vial |
| Fetal bovine serum | Gibco | 923119 | 500 mL vial |
| Dulbecco's modified Eagle's medium | Gibco | 31600-034 | Powder |
| Keratinocyte-SFM medium | Gibco | 10744-019 | 500 mL vial |
| T25 culture flask | TPP | 90025 | VENT type |
| 6-well plate | Falcon | 1209938 | – |
| Immunocytochemistry: | |||
| Phospate-buffered saline | Gibco | 654471 | 500 mL vial |
| Acetic acid glacial | Ferak | Art. -Nr. 00697 | 500 mL vial |
| NP-40 surfactant (Tergitol solution) | Sigma | 056K0151 | 500 mL vial |
| Normal goat serum | Vector Laboratories | S-1000-20 | 20 mL vial, concentrate |
| Nestin (primary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-23927 | – |
| Donkey anti-mouse-fluorescein isothiocyanate (secondary antibody) | Santa Cruz Biotechnology | SC-2099 | – |
| Hoechst 33342 | Anaspec | AS-83218 | 5 mL vial |
| In vivo biocompatibility test: | |||
| Tiletamine+zolazepam | Virbac | BC91 | 5 mL vial |
| Xylazine | Bayer korea | KR03227 | 10 mL vial |
| Ketoprofen | Astar | 1406232 | 2 mL vial |
| Povidone-iodine solution | Everstar | HA161202 | 4 L barrel |
| Cefazolin | China Chemical & Pharmaceutical | 18P909 | 1 g vial |
| Scalpel blade | Shinetec instruments | ST-B021 | – |
| Surgical scissor | Shinetec instruments | ST-B021 | – |
Referências
- Bagnall, A. M., Jones, L., Duffy, S., Riemsima, R. P. Spinal fixation surgery for acute traumatic spinal cord injury. Cochrane Database of Systematic Reviews. 1, 004725 (2008).
- Fehlings, M. G., Perrin, R. G. The role and timing of early decompression for cervical spinal cord injury: update with a review of recent clinical evidence. Injury. 36, 13-26 (2005).
- Yang, L., Jones, N. R., Stoodley, M. A., Blumbergs, P. C., Brown, C. J. Excitotoxic model of post-traumatic syringomyelia in the rat. Spine. 26, 1842-1849 (2001).
- Rolls, A., et al. Two faces of chondroitin sulfate proteoglycan in spinal cord repair: a role in microglia/macrophage activation. PLoS Medicine. 5, 1262-1277 (2008).
- Properzi, F., Asher, R. A., Fawcett, J. W. Chondroitin sulphate proteoglycans in the central nervous system: changes and synthesis after injury. Biochemical Society Transactions. 31, 335-336 (2003).
- Fawcett, J. W., Asher, R. A. The glial scar and central nervous system repair. Brain Research Bulletin. 49, 377-391 (1999).
- Yang, Z., Mo, L., Duan, H., Li, X. Effects of chitosan/collagen substrates on the behavior of rat neural stem cells. Science China Life Sciences. 53, 215-222 (2010).
- Chawla, K. K. . Fibrous Materials. , (1998).
- Pickering, K. L., Aruan Efendy, M. G. A review of recent developments in natural fibre composites and their mechanical performance. Composites Part A-Applied Science and Manufacturing. 83, 98-112 (2016).
- Lundgren, H. P. Synthetic fibers made from proteins. Advances in Protein Chemistry. 5, 305-351 (1954).
- Radishevskii, M. B., Serkov, A. T. Coagulation mechanism in wet spinning of fibres. Fibre Chemistry. 37, 266-271 (2005).
- Yannas, I. V. Collagen and gelatin in the solid state. Journal of Macromolecular Science Part C Polymer Reviews. 7, 49-106 (1972).
- Baer, E., Cassidy, J. J., Hiltner, A. Hierarchical structure of collagen composite Systems: lessons from biology. Pure and Applied Chemistry. 6, 961-973 (2009).
- Harrington, W. F., Von Hippel, P. H. The structure of collagen and gelatin. Advances in Protein Chemistry. 16, 1-138 (1961).
- Veis, A. . The Macromolecular Chemistry of Gelatin. , (1994).
- Freyman, T. M., Yannas, I. V., Gibson, L. J. Cellular materials as porous scaffolds for tissue engineering. Progress in Materials Science. 46, 273-282 (2001).
- Michalczyk, K., Ziman, M. Nestin structure and predicted function in cellular cytoskeletal organization. Histology and Histopathology. 20, 665-671 (2005).
