Påvisande av proteas aktivitet av fluorescerande peptid Zymography
Summary
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för en modifierad zymographic teknik som används fluorescerande peptider som nedbrytbart substrat i stället för infödda proteiner. Elektrofores av biologiska prover i fluorescerande peptid zymograms möjliggör detektering av ett bredare utbud av proteaser än tidigare zymographic tekniker.
Abstract
Syftet med denna metod är att mäta den proteolytiska aktiviteten av komplexa biologiska prover. Proverna är separerade med molekylvikt med elektrofores genom en lösa gel inbäddade med ett nedbrytbart substrat. Denna metod skiljer sig från traditionella gel zymography däri en kylda fluorogenic peptid är kovalent införlivas med lösa gelen istället för full längd proteiner, såsom gelatin eller kasein. Användning av fluorogenic peptiderna ger direkt detektering av proteolytiska aktivitet utan ytterligare åtgärder för färgning. Enzymer inom de biologiska proverna klyva den kylda fluorogenic peptiden, vilket resulterar i en ökning fluorescens. Fluorescerande signalen i gelerna är sedan avbildas med en fluorescerande standardgel scanner och kvantifieras med hjälp av densitometry. Användningen av peptider som nedbrytbart substrat expanderar kraftigt de möjliga proteaser kan upptäckas med zymographic tekniker.
Introduction
Gel zymography är en biologisk teknik som används för att mäta proteolytiska aktivitet inom biologiska prover, såsom kroppsvätskor eller cell kultur media1,2,3. Proverna är åtskilda av deras molekylvikter med elektrofores genom en polyakrylamidgel inbäddade med ett nedbrytbart substrat. Gemensamma nedbrytbart substrat inkluderar gelatin, kasein, kollagen och elastin, som har använts för att mäta aktiviteten av matrix metalloproteinaser (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 och -11, förutom en mängd cathepsins1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. efter elektrofores, enzymerna renatured och tillåtas försämra proteinet i gelen. I traditionella gel zymography, gelen är målat med ett protein färgämne, såsom Coomassie Blue, och proteas aktivitet upptäcks som en förlust av signal, dvs vita band (nedbrytning av protein) på en Mörkblå bakgrund.
Här beskriver vi ett protokoll för en alternativ metod för gel zymography, där nedbrytbart substrat är en kort, fluorogenic peptid kovalent införlivas Polyakrylamidgelen (figur 1). Substitution av syntetiska peptider som de nedbrytbara substratesna möjliggör detektering av ett bredare utbud av proteaser jämfört med traditionella gel zymography med infödda proteiner9. Kovalent sammanlänkningen av fluorogenic peptiden förhindrar peptid diffusion och migration under gelelektrofores observerats med föregående metoder9,10. Dessutom möjliggör användning av ett fluorogenic substrat direkt påvisande av proteas aktivitet utan ytterligare färgning och de färgning steg. Det övergripande målet med denna metod är detektion av proteas aktivitet i biologiska prover via kovalenta införlivandet av fluorogenic peptider i zymogram geler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aktuella zymographic tekniker förlitar sig på införlivandet av infödda substrat i polyakrylamidgeler för detektion av proteolys. Medan dessa tekniker har samlat utbredd användning, är de fortfarande begränsade antal proteaser som de kan upptäcka. Här, beskrevs ett protokoll i som fluorescerande, proteas-degradable peptider är införlivade i polyakrylamid lösa gel. Kovalent koppling använder en azid-PEG3-maleimide linker molekyl möjliggör separation och detektion av ett bredare utbud av proteaser än är f?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering tillhandahålls av The Ohio State University College of Engineering, Biomedical Engineering Department och den omfattande Cancer Center – Arthur G. James Cancer Hospital och Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referências
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
