الكشف عن نشاط البروتياز الببتيد نيون زيموجرافي
Summary
نقدم هنا، بروتوكول مفصل لتقنية زيموجرافيك معدلة التي تستخدم الببتيدات فلوري كالركيزة القابلة للتحلل بدلاً من البروتينات الأصلية. التفريد العينات البيولوجية في الببتيد نيون زيموجرامس تمكن من كشف طائفة أوسع من البروتياز تقنيات زيموجرافيك السابقة.
Abstract
والغرض من هذا الأسلوب لقياس النشاط proteolytic العينات البيولوجية المعقدة. يتم فصل العينات بالوزن الجزيئي باستخدام التفريد من خلال حل جل المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. يختلف هذا الأسلوب عن زيموجرافي هلام التقليدية في ببتيد فلوروجينيك مروي تساهمي أدمجت في جل حل بدلاً من كامل طول البروتينات، مثل الجيلاتين أو الكازين. استخدام الببتيدات فلوروجينيك تمكن من كشف مباشرة من نشاط proteolytic دون خطوات إضافية المصبوغة. الإنزيمات في عينات بيولوجية تنشق الببتيد فلوروجينيك مروي، أدى إلى زيادة في الأسفار. إشارة مضيئة في المواد الهلامية ثم تصويرها مع ماسح ضوئي جل فلورسنت قياسية وكمياً باستخدام قياس كثافة. استخدام الببتيدات كالركيزة القابلة للتحلل يوسع إلى حد كبير البروتياز المحتملة القابلة للاكتشاف مع تقنيات زيموجرافيك.
Introduction
زيموجرافي هلام تقنية بيولوجية المستخدمة لقياس النشاط proteolytic داخل العينات البيولوجية، مثل سوائل الجسم أو الخلية وسائط الثقافة1،،من23. يتم فصل العينات أوزانها الجزيئية مع التفريد خلال جل polyacrylamide المضمنة مع ركيزة القابلة للتحلل. وتشمل مشتركة الركازات التحلل الجيلاتين، الكازين، الكولاجين والايلاستين، التي استخدمت لقياس نشاط ميتالوبروتيناسيس مصفوفة (يتولى)-1،-2،-3،-7،-8،-9، و-11، بالإضافة إلى مجموعة متنوعة من كاثيبسينس1،2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8-بعد التفريد، الإنزيمات ريناتوريد وسمحت للحط من البروتين داخل الجل. في زيموجرافي هلام التقليدية، الهلام هو ملطخة بصبغة بروتين، مثل أخذ الأزرق، وتم الكشف عن نشاط البروتياز كفقدان إشارة، وعصابات (تحلل البروتين) أي أبيض على خلفية زرقاء داكنة.
هنا، يمكننا وصف بروتوكول لطريقة بديلة لجل زيموجرافي، الذي الركيزة القابلة للتحلل قصيرة، الببتيد فلوروجينيك تساهمي أدرجت في جل polyacrylamide (الشكل 1). الاستعاضة عن الببتيدات الاصطناعية كركائز للتحلل تمكن من كشف مجموعة أوسع نطاقا من البروتياز بالمقارنة مع زيموجرافي هلام التقليدية مع البروتينات الأصلية9. الروابط التساهمية من الببتيد فلوروجينيك يمنع نشر الببتيد والهجرة أثناء التفريد جل لاحظ مع الأساليب السابقة9،10. علاوة على ذلك، يمكن استخدام الركيزة فلوروجينيك الكشف المباشر لنشاط البروتياز دون تلطيخ إضافية وخطوات إزالة المصبوغة. والهدف العام لهذا الأسلوب هو الكشف عن نشاط البروتياز في العينات البيولوجية عن طريق إدماج الببتيدات فلوروجينيك في الهلام زيموجرام التساهمية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقنيات زيموجرافيك الحالية تعتمد على إدماج ركائز الأصلية في المواد الهلامية polyacrylamide للكشف عن بروتيوليسيس. بينما حصل هذه التقنيات على استخدامها على نطاق واسع، أنها لا تزال محدودة في عدد البروتياز أنها يمكن الكشف عن. هنا، كان وصف بروتوكول في الببتيدات الفلورسنت، والقابلة للتحلل البروتياز ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يوفر التمويل ولاية أوهايو الدولة جامعة كلية الهندسة وقسم الهندسة الطبية الحيوية، ومركز السرطان الشامل-آرثر ج. جيمس مستشفى السرطان وريتشارد ج. سلف معهد البحوث.
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referências
- Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes. Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).
- Toth, M., Fridman, R. Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography. Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochemistry. 102 (1), 196-202 (1980).
- Gogly, B., Groult, N., Hornebeck, W., Godeau, G., Pellat, B. Collagen zymography as a sensitive and specific technique for the determination of subpicogram levels of interstitial collagenase. Analytical Biochemistry. 255 (2), 211-216 (1998).
- Inanc, S., Keles, D., Oktay, G. An improved collagen zymography approach for evaluating the collagenases MMP-1, MMP-8, and MMP-13. BioTechniques. 63 (4), 174-180 (2017).
- Perera, H. K. I. Detection of Aspartic Proteinase Activities Using Gel Zymography. Zymography. , 43-52 (2017).
- van Beurden, P. A. M. S. n. o. e. k. -., Vonden Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. BioTechniques. 38 (1), 73-83 (2005).
- Oliver, G. W., Stetler-Stevenson, W. G., Kleiner, D. E., Zymography, Zymography, Casein Zymography, and Reverse Zymography: Activity Assays for Proteases and their Inhibitors. Proteolytic Enzymes. Springer Lab Manual. , 63-76 (1999).
- Deshmukh, A. A., Weist, J. L., Leight, J. L. Detection of proteolytic activity by covalent tethering of fluorogenic substrates in zymogram gels. BioTechniques. 64 (5), 203-210 (2018).
- Yasothornsrikul, S., Hook, V. Y. Detection of proteolytic activity by fluorescent zymogram in-gel assays. BioTechniques. 28 (6), 1172-1173 (2000).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Leight, J. L., Tokuda, E. Y., Jones, C. E., Lin, A. J., Anseth, K. S. Multifunctional bioscaffolds for 3D culture of melanoma cells reveal increased MMP activity and migration with BRAF kinase inhibition. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (17), 5366-5371 (2015).
- Ren, Z., Chen, J., Khalil, R. A. Zymography as a Research Tool in the Study of Matrix Metalloproteinase Inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1626, 79-102 (2017).
- Nagase, H., Fields, G. B. Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide. Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).
- Mucha, A., et al. Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions. Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).
- Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -. L., Gatti, J. -. L. One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).
- Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva. Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).
- Yu, W., Woessner, J. F. Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases. Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).
