Détection d’activité de la protéase par Zymographie peptides fluorescents
Summary
Nous présentons ici un protocole détaillé pour une technique mis à jour le zymographic dans lequel les peptides fluorescents sont utilisés comme substrat biodégradable en lieu et place des protéines natives. Électrophorèse d’échantillons biologiques dans zymogrammes de peptides fluorescents permet la détection d’un plus large éventail de protéases que les techniques de zymographic précédente.
Abstract
Le but de cette méthode est de mesurer l’activité protéolytique des échantillons biologiques complexes. Les échantillons sont séparés par le poids moléculaire en utilisant l’électrophorèse par un gel résolution intégré avec un substrat biodégradable. Cette méthode diffère de zymographie gel traditionnel qu’un peptide fluorogène trempé est par covalence incorporé dans le gel résolution au lieu de protéines pleine longueur, tels que la gélatine ou de la caséine. Utilisation des peptides fluorogène permet une détection directe de l’activité protéolytique sans coloration des étapes supplémentaires. Enzymes dans les échantillons biologiques fendent le peptide fluorogène trempés, résultant en une augmentation de fluorescence. Le signal fluorescent dans les gels est alors photographié avec un scanner de gel fluorescent standard et quantifiées par densitométrie. L’utilisation de peptides comme le substrat biodégradable élargit considérablement les protéases possibles détectables avec les techniques de zymographic.
Introduction
Zymographie gel est une technique biologique utilisée pour mesurer l’activité protéolytique dans des échantillons biologiques, tels que des fluides corporels ou des milieux de culture de cellule pour1,2,3. Les échantillons sont séparées par leurs poids moléculaires avec électrophorèse par un gel de polyacrylamide embarqué avec un substrat biodégradable. Substrats dégradables communs incluent gélatine, caséine, collagène et élastine, qui ont été utilisés pour mesurer l’activité des métalloprotéinases matricielles (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 et -11, en plus d’une variété de cathepsines1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. après électrophorèse, les enzymes sont renaturé et laisse se pour dégrader les protéines dans le gel. En gel traditionnel zymographie, le gel est coloré avec un colorant de la protéine, comme le bleu de Coomassie, et activité de la protéase est détectée comme une perte de signal, c’est-à-dire blanc bandes (dégradation des protéines) sur un fond bleu foncé.
Nous décrivons ici un protocole pour une autre méthode de gel zymographie, dans laquelle le substrat biodégradable est un court, peptide fluorogénique par covalence incorporé dans le gel de polyacrylamide (Figure 1). La substitution de peptides synthétiques comme les substrats dégradables permet la détection d’un plus large éventail de protéases contre zymographie gel traditionnel avec des protéines natives9. Liaison covalente du peptide fluorogène empêche la diffusion de peptide et de migration au cours de l’électrophorèse sur gel, observée avec les précédentes méthodes9,10. De plus, l’utilisation d’un substrat fluorogène permet la détection directe de l’activité de la protéase sans coloration supplémentaire et étapes de coloration. L’objectif général de cette méthode est la détection de l’activité protéase dans des échantillons biologiques via l’incorporation covalente des peptides fluorogéniques dans les gels zymogramme.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les techniques actuelles de zymographic s’appuient sur l’incorporation des substrats indigènes dans des gels de polyacrylamide pour la détection de la protéolyse. Alors que ces techniques ont rallié la généralisation, elles sont encore limitées dans le nombre des protéases, qu’ils peuvent détecter. Ici, un protocole a été décrite dans les peptides fluorescents, protéase-dégradables sont incorporés dans le polyacrylamide gel de résoudre. À l’aide de couplage covalent une molécule azido-PEG3-maléim…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financement fourni par The Ohio State University College of Engineering, département de génie biomédical et le Comprehensive Cancer Center – Arthur G. James Cancer Hospital et Richard J. Solove Research Institute.
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
Referências
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