फ्लोरोसेंट पेप्टाइड Zymography द्वारा चिढ़ा गतिविधि का पता लगाने
Summary
यहां, हम एक संशोधित zymographic तकनीक है जिसमें फ्लोरोसेंट पेप्टाइड्स देशी प्रोटीन के स्थान पर सड़ सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल मौजूद । फ्लोरोसेंट पेप्टाइड zymograms में जैविक नमूनों की ट्रो पिछले zymographic तकनीकों की तुलना में एक व्यापक रेंज का पता लगाने में सक्षम बनाता है ।
Abstract
इस विधि का उद्देश्य जटिल जैविक नमूनों की proteolytic गतिविधि को मापने का है । नमूनों आणविक वजन एक संपति एक सड़ सब्सट्रेट के साथ एम्बेडेड जेल के माध्यम से ट्रो का उपयोग करके अलग कर रहे हैं । इस विधि में पारंपरिक जेल zymography से अलग है कि एक बुझती fluorogenic पेप्टाइड covalently के बजाय पूर्ण लंबाई प्रोटीन, जैसे जिलेटिन या कैसिइन के समाधान जेल में शामिल किया गया है । fluorogenic पेप्टाइड्स का उपयोग अतिरिक्त दाग कदम के बिना proteolytic गतिविधि का प्रत्यक्ष पता लगाने में सक्षम बनाता है । जैविक नमूनों के भीतर एंजाइमों बुझती fluorogenic पेप्टाइड, प्रतिदीप्ति में वृद्धि में जिसके परिणामस्वरूप सट । जैल में फ्लोरोसेंट संकेत तो एक मानक फ्लोरोसेंट जेल स्कैनर और densitometry का उपयोग कर quantified के साथ छवि है । पदावनति सब्सट्रेट के रूप में पेप्टाइड्स का उपयोग काफी संभव zymographic तकनीकों के साथ detectable का पता लगाता है का विस्तार ।
Introduction
जेल zymography जैविक नमूनों के भीतर proteolytic गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया एक जैविक तकनीक है, जैसे शरीर के तरल पदार्थ या सेल संस्कृति मीडिया1,2,3. नमूने ट्रो के साथ एक polyacrylamide जेल एक सड़ सब्सट्रेट के साथ एंबेडेड के माध्यम से उनके आणविक भार से अलग कर रहे हैं । आम सड़ सब्सट्रेट जिलेटिन शामिल हैं, कैसिइन, कोलेजन और elastin, जो मैट्रिक्स metalloproteinases की गतिविधि को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, और-11, cathepsins की एक किस्म के अलावा1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. ट्रो के बाद, एंजाइमों स्वभाविक और जेल के भीतर प्रोटीन नीचा करने के लिए अनुमति दी जाती है । पारंपरिक जेल zymography में, जेल एक प्रोटीन डाई के साथ दाग है, इस तरह के Coomassie नीले रंग के रूप में, और एक गहरी नीली पृष्ठभूमि पर सफेद बैंड (प्रोटीन की गिरावट), यानी, संकेत की हानि के रूप में पता चला है ।
यहां, हम जेल zymography की एक वैकल्पिक पद्धति के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है, जिसमें सड़ सब्सट्रेट एक छोटी, fluorogenic पेप्टाइड covalently polyacrylamide जेल (चित्रा 1) में शामिल किया गया है । क्षरण सब्सट्रेट के रूप में सिंथेटिक पेप्टाइड के प्रतिस्थापन के रूप में देशी प्रोटीन9के साथ पारंपरिक जेल zymography की तुलना में एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है । fluorogenic पेप्टाइड के आबंध लिंकेज पेप्टाइड प्रसार और जेल ट्रो के दौरान प्रवास को रोकता है पिछले तरीकों9,10के साथ मनाया । इसके अलावा, एक fluorogenic सब्सट्रेट के उपयोग अतिरिक्त धुंधला और de-धुंधला कदम के बिना गतिविधि को छेड़ने का प्रत्यक्ष पता लगाने में सक्षम बनाता है । इस विधि का समग्र लक्ष्य zymogram जैल में fluorogenic पेप्टाइड्स के आबंध के माध्यम से जैविक नमूनों में गतिविधि को छेड़ने का पता लगाने है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान zymographic तकनीक प्रोटियोलिसिस का पता लगाने के लिए polyacrylamide जैल में देशी सब्सट्रेट का निगमन पर भरोसा करते हैं । हालांकि इन तकनीकों का व्यापक उपयोग हुआ है, वे अभी भी वे का पता लगा सकते है की संख्या में सीमि…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
वित्तपोषण ओहियो राज्य विश्वविद्यालय इंजीनियरिंग, बायोमेडिकल इंजीनियरिंग विभाग के कॉलेज, और व्यापक कैंसर केंद्र आर्थर जी जेंस कैंसर अस्पताल और रिचर्ड जे Solove अनुसंधान संस्थान द्वारा प्रदान की है ।
Materials
| 1.5 mm Empty Gel Cassettes | ThermoFisher Scientific | NC2015 | |
| 1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs | ThermoFisher Scientific | NC3510 | |
| 1x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 10-010-049 | |
| 20% SDS Solution | Ambion | AM9820 | |
| 3x Zymography Sample Buffer | Bio-Rad | 1610764 | |
| 40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1) | Ambion | AM9022 | |
| 6 Well Tissue Culture Plates | ThermoFisher Scientific | 087721B | |
| Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO) | Sigma-Aldrich | UFC201024 | |
| Ammounium Persulfate | Sigma-Aldrich | A3678 | |
| Azido-PEG3-Maleimide Kit | Click Chemistry Tools | AZ107 | |
| Calcium Chloride | ThermoFisher Scientific | BP510100 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fisher Scientific | BP231 | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A416P | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| PowerPac Basic Power Supply | Bio-Rad | 1645050 | |
| Precision Plus Protein Dual Color Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
| PrecisionGlide Hypodermic Needles | Fisher Scientific | 14-826 | |
| Round Bottom Flask (100 mL) | Fisher Scientific | 50-873-144 | |
| Septum Rubber Stopper | Fisher Scientific | 50-872-546 | |
| Sterile Slip Tip Syringe (1 mL) | Fisher Scientific | 14-823-434 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trizma hydrochlroide | Sigma-Aldrich | T5941 | |
| Typhoon 9410 Molecular Imager | GE Amersham | 8149-30-9410 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086 |
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