형광 성 펩 티 드 Zymography에 의해 프로 테아 제 활동의 탐지

Summary

여기, 형광 펩 티 드 대신 네이티브 단백질 분해성 기판으로 사용 되는 수정 된 zymographic 기법에 대 한 자세한 프로토콜 선물이. 전기 이동 법 형광 펩 티 드 zymograms에 생물 학적 샘플의 이전 zymographic 기법 보다는 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다.

Abstract

이 방법의 목적은 복잡 한 생물 학적 샘플의 분해 활동을 측정 하는 것입니다. 샘플 분자량 분해성 기판 임베디드 해결 젤 통해 전기 이동 법을 사용 하 여 구분 됩니다. 이 방법은 다릅니다 전통적인 젤 zymography에서 담금질된 fluorogenic 펩 티 드 covalently 전체 길이 단백질, 젤라틴 또는 카 세 인 등 대신 해결 젤에 통합 됩니다. Fluorogenic 펩 티 드의 사용에는 추가 착 단계 없이 분해 활동의 직접 감지 수 있습니다. 생물 학적 샘플 내에서 효소 쪼개 침묵과 fluorogenic 펩 티 드, 형광에 있는 증가 결과로. 젤에 형광 신호 다음 표준 형광 젤 스캐너로 몇 군데 이며 densitometry를 사용 하 여 계량 합니다. 분해성 기판으로 펩 티 드를 사용 하 여 크게 zymographic 기술로 감지 가능한 프로 테아 제를 확장합니다.

Introduction

젤 zymography은 생물 학적 샘플, 체액 세포 배양^1,2,3등 분해 활동을 측정 하는 생물학 기술입니다. 샘플 그들의 분자 무게 분해성 기판 임베디드 polyacrylamide 젤을 통해 전기 이동 법으로 구분 됩니다. 젤라틴, 카 세 인, 콜라겐과 엘라 스 틴, 매트릭스 metalloproteinases (MMPs)-1,-2,-3,-7,-8,-9, 및-11, cathepsins^1,2 의 다양 한 뿐만 아니라의 활동을 측정 하기 위해 사용 된 일반적인 분해성 기판 포함 ^{, 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. 후 전기 이동 법, 효소 renatured와 젤 내 단백질을 저하 될 수. 전통적인 젤 zymography, 젤 Coomassie 파란 등 단백질 염료와 스테인드 하 고 효소 활동 즉, 흰색 밴드 (단백질의 저하)는 진한 파란색 배경에 신호의 손실으로 감지 합니다.

여기, 우리는 젤 zymography, 있는 분해성 기판은 짧은, fluorogenic 펩 티 드 covalently polyacrylamide 젤 (그림 1)에 통합 하는 대체 방법에 대 한 프로토콜을 설명 합니다. 분해성 기판으로 합성 펩 티 드의 대체 기본 단백질⁹전통적인 젤 zymography에 비해 프로 테아의 광범위의 검색 수 있습니다. Fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 펩 티 드 보급 및 이전 방법^9,10관찰 하는 젤 전기 이동 법 동안 마이그레이션 방지 합니다. 또한, fluorogenic 기판의 사용은 추가 얼룩-얼룩 단계 없이 프로 테아 제 활동의 직접 검출을 수 있습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 zymogram 젤에서 fluorogenic 펩 티 드의 공유 결합을 통해 생물학 견본에서 효소 활동의 탐지.

Protocol

1입니다. 해결 젤 층의 준비 10 %polyacrylamide 젤 솔루션 표 1에 의하여 해결을 준비 합니다. 즉시 그들의 추가 시작 중 합 반응으로 젤을 따르기 이전 Tetramethylethylenediamine (TEMED)와 암모늄 Persulfate (AP)를 추가 합니다. 10% 해결 젤 솔루션 빈 1.5 m m 미니 젤 카세트 절반 방법 (5 mL)을 작성. 레벨 젤 생산 및 거품 방지 polyacrylamide 젤의 맨 소 프로 파 놀 (~ 500 µ L)의 얇은 레이?…

Representative Results

여기 설명 하는 방법을 사용 하 여, 두 개의 형광 효소 분해 펩 티 드 polyacrylamide 젤에 통합 했다: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (텍스트와 그림을 통해 QGIW로 약식)와 GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (텍스트와 그림을 통해 LACW로 약식). ↓ 분열의 위치를 나타냅니다. QGIW는 콜라겐은-난 파생 시퀀스 세포 collagenases14을 탐지 하도록 설계 되었습니다. LACW는 MMP …

Discussion

현재 zymographic 기법으로 polyacrylamide 젤 베이스의 검출에 대 한 기본 기판의 설립에 의존합니다. 이러한 기술을 광범위 하 게 사용을 얻고 있다, 하는 동안 그들은 여전히 프로 테아 제 감지할 수의 숫자에 제한 됩니다. 여기, 프로토콜은 형광, 효소 분해 펩 티 드에 polyacrylamide 젤 해결에 통합 하는 설명 했다. 사용 하 여 연결 공유는 azido-PEG3-maleimide 링커 분자 수 있습니다 분리 및 다양 한 프로 테아?…

Materials

1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086