Påvisning av Protease aktivitet av fluorescerende peptid Zymography

Summary

Her presenterer vi en detaljert protokoll for en modifisert zymographic teknikk som brukes fluorescerende peptider som nedbrytbart underlaget i stedet for native proteiner. Geleelektroforese av biologiske prøver i fluorescerende peptid zymograms gjør påvisning av et bredere spekter av proteaser enn forrige zymographic teknikker.

Abstract

Formålet med denne metoden er å måle proteolytiske av komplekse biologiske prøver. Prøvene er atskilt med molekylvekt bruker geleelektroforese gjennom en retting gel innebygd med en nedbrytbar substrat. Denne metoden er forskjellig fra tradisjonell gel zymography i et let fluorogenic peptid bygges covalently inn løse gel i stedet for full lengde proteiner, som gelatin eller kasein. Bruk av fluorogenic peptider gjør direkte deteksjon av proteolytisk aktivitet uten flekker forholdsregler. Enzymer i de biologiske prøvene cleave Let fluorogenic peptid, resulterer i en økning i fluorescens. Fluorescerende signalet i geléer er da fotografert med en standard fluorescerende gel skanner og kvantifisert ved hjelp av densitometry. Bruk av peptider som nedbrytbart underlaget utvider mulig proteaser synlig med zymographic teknikker.

Introduction

Gel zymography er en biologisk teknikk som brukes til å måle proteolytisk aktivitet innen biologiske prøver, som kroppsvæsker eller celle kultur medier^1,2,3. Prøvene er atskilt med deres molekylvekt med geleelektroforese gjennom en polyakrylamid gel innebygd med en nedbrytbar substrat. Vanlige nedbrytbart underlag inkluderer gelatin, kasein, kollagen og elastin, som har blitt brukt til å måle aktiviteten til matrise metalloproteinases (MMPs) -1 -2, -3, -7,-8,-9 og-11, i tillegg til en rekke cathepsins^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. etter geleelektroforese, enzymer er rehabilitert og lov til å svekke protein i gel. I tradisjonell gel zymography, gel er farget med en protein fargestoff, for eksempel Coomassie blå, og protease-aktiviteten er registrert som tap av signal, dvs. hvite band (nedbrytning av protein) på en mørk blå bakgrunn.

Her beskriver vi en protokoll for en alternativ metode for gel zymography, der nedbrytbart underlaget er en kort, fluorogenic peptid covalently innlemmet i polyakrylamid gel (figur 1). Substitusjon av syntetiske peptider som nedbrytbart substrater gjør påvisning av et bredere spekter av proteaser sammenlignet med tradisjonelle gel zymography med innfødt proteiner⁹. Kovalente kombinasjon av fluorogenic peptid forhindrer peptid diffusjon og migrasjon ved gel geleelektroforese observert med tidligere metoder^9,10. Videre gjør bruk av en fluorogenic substrat direkte deteksjon av protease aktivitet uten ekstra flekk og fjern flekker skritt. Det overordnede målet med denne metoden er oppdagelsen av protease aktivitet i biologiske prøver via kovalente inkorporering av fluorogenic peptider i zymogram gels.

Protocol

1. forberedelse av løse Gel laget Forberede en 10% polyakrylamid løse gel løsningen som per tabell 1. Legg til Tetramethylethylenediamine (TEMED) og Ammonium Persulfate (APS) umiddelbart før strømme gel som tillegg starter polymerisasjon reaksjonen. Fylle en tom 1,5 mm mini gel kassett halvveis (5 mL) med 10% løse gel løsningen. Legg et tynt lag med isopropanol (~ 500 µL) til toppen av polyakrylamid gel å produsere en nivå gel og hindre bobler. Bruke leftover polya…

Representative Results

Med metoden beskrevet her to fluorescerende protease-nedbrytbar peptider ble innlemmet i polyakrylamid gels: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (forkortet til QGIW i tekst og tall) og GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (forkortet til LACW i hele teksten og tallene). ↓ angir området cleavage. QGIW er en kollagen-jeg avledet sekvens utviklet for å oppdage mobilnettet collagenases14. LACW er en sekvens som er optimalisert for påvisning av MMP-14 og MM…

Discussion

Gjeldende zymographic teknikker er avhengige av inkorporering av innfødte underlag polyakrylamid gels for påvisning av proteolyse. Mens disse teknikkene har fått utbredt bruk, er de fortsatt begrenset i antall proteaser de kan oppdage. Her, ble en protokoll som beskrevet i hvilke fluorescerende, protease-nedbrytbar peptider er innlemmet i polyakrylamid løse gel. Kovalente kopling med en azido-PEG3-maleimide koblingsfunksjonalitet molekyl aktiverer separasjon og påvisning av flere proteaser enn er for tiden oppnåeli…

Materials

1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086