Deteção da atividade de Protease por zimografia peptídeo fluorescente

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para uma técnica modificada de zymographic na qual fluorescentes peptídeos são usados como substrato degradável no lugar de proteínas nativas. Eletroforese de amostras biológicas em Zimogramas peptídeo fluorescente permite a detecção de uma gama maior de proteases que as técnicas de zymographic anterior.

Abstract

A finalidade desse método é medir a atividade proteolítica de amostras biológicas complexas. As amostras são separadas por peso molecular usando electroforese através de um gel de resolução incorporado com um substrato degradável. Esse método difere zimografia tradicional gel, em que um peptídeo extinto fluorogenic covalentemente é incorporado o gel de resolução em vez de proteínas de comprimento total, tais como gelatina ou de caseína. Uso dos peptides fluorogenic permite a detecção direta de atividade proteolítica sem etapas adicionais de coloração. As enzimas dentro as amostras biológicas cleave o peptídeo fluorogenic temperada, resultando em um aumento na fluorescência. O sinal fluorescente no gel é então fotografada com um scanner padrão gel fluorescente e quantificados utilizando densitometria. O uso de peptídeos como substrato degradável grandemente expande as proteases possíveis detectáveis com técnicas de zymographic.

Introduction

Zimografia gel é uma técnica biológica usada para medir a atividade proteolítica dentro de amostras biológicas, tais como fluidos corporais ou meios de cultura de células a^1,2,3. As amostras são separadas por seus pesos moleculares com a eletroforese através de um gel de polyacrylamide incorporado com um substrato degradável. Substratos degradáveis comuns incluem gelatina, caseína, colágeno e elastina, que foram utilizados para medir a atividade de metaloproteinases de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, além de uma variedade de cathepsins^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. após eletroforese, as enzimas são renatured e permitido para degradar a proteína dentro do gel. Em zimografia tradicional gel, o gel está manchado com uma tintura de proteína, tais como o azul de Coomassie, e atividade de protease é detectada como uma perda de sinal, ou seja, branco de bandas (degradação da proteína) em um fundo azul escuro.

Aqui, descrevemos um protocolo para um método alternativo de zimografia de gel, em que o substrato degradável é um curto-circuito, fluorogenic peptídeo covalentemente incorporado o gel de poliacrilamida (Figura 1). A substituição de peptídeos sintéticos como os substratos degradáveis permite a detecção de uma gama maior de proteases em comparação com o tradicional gel zimografia com proteínas nativas⁹. Ligação covalente do peptide fluorogenic impede a difusão do peptide e migração durante a electroforese do gel observado com anteriores métodos^9,10. Além disso, o uso de um substrato fluorogenic permite detecção direta de atividade de protease sem coloração adicionais e passos de coloração. O objectivo geral deste método é a detecção de atividade de protease em amostras biológicas através a incorporação covalente de peptídeos fluorogenic em géis de zymogram.

Protocol

1. preparação da camada de Gel de resolução Prepare uma poliacrilamida 10% resolução solução de gel, conforme tabela 1. Adicione o tempted (TEMED) e persulfato de amónio (APS) imediatamente antes de derramar o gel como sua adição inicia a reação de polimerização. Encha uma gaveta de mini gel vazio 1,5 mm (5 mL) a meio caminho com a solução 10% de gel de resolução. Adicione uma camada fina de isopropanol (~ 500 µ l) na parte superior do gel de polyacrylami…

Representative Results

Usando o método descrito aqui, dois péptidos protease-degradáveis fluorescentes foram incorporados em géis de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abreviado como QGIW ao longo do texto e figuras) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abreviado como LACW ao longo do texto e figuras). ↓ indica o local de clivagem. QGIW é um colágeno-que derivei sequência projetada para detectar colagenases celular14. LACW é uma sequência que foi …

Discussion

As técnicas atuais de zymographic contam com a incorporação de substratos nativos em gel de poliacrilamida para a detecção de proteólise. Enquanto estas técnicas têm alcançado uso generalizado, eles ainda são limitados no número de proteases podem detectar. Aqui, um protocolo foi descrito em quais peptídeos fluorescentes, protease-degradáveis são incorporados a resolução de gel de poliacrilamida. Ligações covalentes acoplamento usando uma molécula de vinculador azido-PEG3-maleimide permite a separaçã…

Materials

1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086