Detección de actividad de la proteasa por Zymography péptido fluorescente

Summary

Aquí, presentamos un protocolo detallado para una técnica de zymographic modificada en la que se utilizan péptidos fluorescentes como el substrato degradable en lugar de proteínas nativas. Electroforesis de muestras biológicas en isoenzimáticos péptido fluorescente permite la detección de una gama más amplia de las proteasas que las anteriores técnicas de zymographic.

Abstract

El propósito de este método es medir la actividad proteolítica de muestras biológicas complejas. Las muestras están separadas por peso molecular mediante electroforesis a través de un gel de resolución con un sustrato degradable. Este método difiere zymography gel tradicional un péptido fluorógenos apagado se incorpora covalentemente en el gel de resolución en lugar de proteínas completas, como gelatina o caseína. Uso de los péptidos fluorógenos permite la detección directa de actividad proteolítica sin pasos adicionales de tinción. Las enzimas dentro de las muestras biológicas hienden el péptido fluorógenos apagado, dando por resultado un aumento en fluorescencia. La señal fluorescente en los geles es entonces reflejada con un escáner estándar gel fluorescente y cuantifica mediante densitometría. El uso de péptidos como el substrato degradable expande considerablemente las proteasas posible detectables con técnicas de zymographic.

Introduction

Zymography gel es una técnica biológica utilizada para medir la actividad proteolítica en las muestras biológicas, tales como fluidos corporales o células medios de cultivo^1,2,3. Las muestras son separadas por sus pesos moleculares con electroforesis a través de un gel de poliacrilamida con un sustrato degradable. Los sustratos degradables comunes incluyen gelatina, caseína, colágeno y elastina, que se han utilizado para medir la actividad de metaloproteinasas de matriz (MMPs) -1, -2, -3, -7, -8, -9 y -11, además de una variedad de catepsinas^{1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8}. después de la electroforesis, las enzimas son renatured y permitido degradar la proteína en el gel. En zymography tradicional gel, el gel se tiñe con un tinte de proteína, como el azul de Coomassie, y actividad de la proteasa se detecta como una pérdida de señal, bandas (degradación de la proteína) es decir, blanco sobre un fondo azul oscuro.

Aquí, describimos un protocolo para un método alternativo de zymography gel, en el que el sustrato degradable es un cortocircuito, péptido fluorógenos incorporada covalentemente en el gel de poliacrilamida (figura 1). La sustitución de péptidos sintéticos como el sustrato degradable permite la detección de una gama más amplia de las proteasas en comparación con el gel tradicional zymography con proteínas nativas⁹. Enlace covalente del péptido fluorógenos previene péptido difusión y migración durante la electroforesis en gel con anteriores métodos^9,10. Además, el uso de un sustrato fluorógenos permite la detección directa de la actividad de las proteasas sin coloración adicional y pasos de tinción. El objetivo general de este método es la detección de actividad de la proteasa en muestras biológicas mediante la incorporación covalente de péptidos fluorógenos en geles de zymogram.

Protocol

1. preparación de la capa de Gel de resolución Preparar una 10% de poliacrilamida resolver solución gel según la tabla 1. Añadir el Tetramethylethylenediamine (TEMED) y persulfato de amonio (APS) inmediatamente antes de verter el gel como su adición inicia la reacción de polimerización. Llene un casete de gel mini vacío 1,5 mm a mitad de camino (5 mL) con la solución 10% de gel de resolución. Añadir una capa delgada de isopropanol (~ 500 μl) a la parte superior …

Representative Results

Empleando el método descrito aquí, se incorporaron dos péptidos proteasa degradable fluorescentes en geles de poliacrilamida: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abreviado como QGIW en todo el texto y figuras) y GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abreviado como LACW en todo el texto y figuras). ↓ indica el sitio de la hendidura. QGIW es un colágeno-derivé secuencia diseñada para detectar colagenasas celular14. LACW es una secuencia que se ha op…

Discussion

Zymographic las técnicas actuales se basan en la incorporación de sustratos nativos en geles de poliacrilamida para la detección de la proteólisis. Mientras que estas técnicas han ganado uso extenso, todavía están limitados en el número de proteasas que pueden detectar. Aquí, un protocolo fue descrito en que péptidos fluorescentes, proteasa degradable se incorporan a la solución de gel de poliacrilamida. Covalente acoplamiento usando una molécula de azido-PEG3-maleimida vinculador permite la separación y la …

Materials

1.5 mm Empty Gel Cassettes	ThermoFisher Scientific	NC2015
1.5 mm, 10 well Empty Gel Cassette Combs	ThermoFisher Scientific	NC3510
1x Phosphate Buffered Saline	Fisher Scientific	10-010-049
20% SDS Solution	Ambion	AM9820
3x Zymography Sample Buffer	Bio-Rad	1610764
40% (w/v) Acrylamide/Bis (19:1)	Ambion	AM9022
6 Well Tissue Culture Plates	ThermoFisher Scientific	087721B
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit (10 kDa MWCO)	Sigma-Aldrich	UFC201024
Ammounium Persulfate	Sigma-Aldrich	A3678
Azido-PEG3-Maleimide Kit	Click Chemistry Tools	AZ107
Calcium Chloride	ThermoFisher Scientific	BP510100
Dimethyl Sulfoxide	Fisher Scientific	BP231
Isopropanol	Fisher Scientific	A416P
Micro BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23235
N N N' N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
PowerPac Basic Power Supply	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	161-0374
PrecisionGlide Hypodermic Needles	Fisher Scientific	14-826
Round Bottom Flask (100 mL)	Fisher Scientific	50-873-144
Septum Rubber Stopper	Fisher Scientific	50-872-546
Sterile Slip Tip Syringe (1 mL)	Fisher Scientific	14-823-434
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trizma hydrochlroide	Sigma-Aldrich	T5941
Typhoon 9410 Molecular Imager	GE Amersham	8149-30-9410
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	208086