Cuantificar la distribución heterogénea de una proteína sináptica en el cerebro de ratón mediante inmunofluorescencia
Summary
Aquí, describimos un enfoque cuantitativo para determinar la distribución de una proteína sináptica en relación con un marcador proteico utilizando tinción de inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis basados en computadoras.
Abstract
La presencia, ausencia o niveles de proteínas sinápticas específicas pueden influir seriamente en transmisión sináptica. Además de dilucidar la función de una proteína, es vital para determinar su distribución. Aquí, describimos un protocolo de empleo de la inmunofluorescencia, microscopia confocal y análisis computarizado para determinar la distribución de la proteína sináptica Mover (también llamado TPRGL o SVAP30). Comparamos la distribución del motor a la de la vesícula sináptica proteína sinaptofisina, determinando la distribución del motor en términos cuantitativos en relación con la abundancia de vesículas sinápticas. En particular, este método podría aplicarse potencialmente para permitir la comparación de la distribución de proteínas con diversos anticuerpos o microscopios o a través de diferentes estudios. Nuestro método evita la variabilidad inherente de los stainings inmunofluorescentes cediendo una relación en lugar de los niveles de fluorescencia absoluta. Además, el método que se describe permite al investigador analizar la distribución de una proteína en diferentes niveles: desde rebanadas de todo el cerebro a regiones del cerebro a diversas subregiones de zona de un cerebro, como las diferentes capas del hipocampo o sensorial cortezas. Es una proteína específica de vertebrados que se asocia con vesículas sinápticas. Con este método, se muestra que Mover es heterogénea en las áreas del cerebro, con altos niveles en el pallidum ventral, el núcleo septal y la amígdala y también en áreas individuales del cerebro, como las diferentes capas del hipocampo.
Introduction
Comunicación entre las neuronas sucede en sitios especializados de contacto denominados sinapsis. Las sinapsis contienen un gran número de proteínas diferentes que orquestar la transmisión sináptica. Algunas de estas proteínas muestran una distribución heterogénea en todo el sistema nervioso y no están presentes en cada sinapsis1. Un ejemplo de tal proteína es Munc13, que participa en el proceso de cebado de vesículas sinápticas. Existen diferentes isoformas de Munc13, que están distribuidos heterogéneamente en el cerebro2, y la presencia o ausencia de isoformas específicas puede influir en la plasticidad sináptica a corto plazo y vesícula sináptica dinámica3, 4 , 5. por lo tanto, es de vital importancia para poder identificar la presencia de diferentes proteínas sinápticas entre áreas del cerebro.
Los métodos de elección para la cuantificación de proteínas sinápticas – hasta ahora – son la espectrometría de masas y de Western Blot, en lugar de inmunohistoquímica6,7,8,9. En algunos casos, se utilizan varios métodos que se complementan entre sí para evaluar la cantidad y la localización de proteínas específicas (es decir, Wilhelm et al. 10). el método se describe aquí permite la localización y cuantificación de proteínas de interés sin la necesidad de utilizar cualquier método bioquímico, simplemente empleando los stainings inmunofluorescentes. Otra ventaja aquí es que la cuantificación puede realizarse sobre áreas mucho más pequeñas y, por lo tanto, más específicos, que el logrado por otros métodos. Sin embargo, hay que tener en cuenta que una proteína de referencia confiable es necesario para evaluar la distribución de la proteína de interés.
Fluorescente de tinción por inmunohistoquímica permite identificar rutinariamente la localización de proteínas entre las áreas del cerebro, así como dentro de diferentes compartimientos neuronales. Para identificar los diferentes compartimentos, se utilizan marcadores específicos. Por lo general, los anticuerpos contra la sinapsina y synaptophysin11 pueden utilizarse para etiqueta de vesículas sinápticas, mientras que la zona activa de un terminal presináptico12la etiqueta anticuerpos contra fagot. Transportadores vesiculares, como los transportadores vesiculares de glutamato (vGluT) o el transportador vesicular de GABA (vGAT), se utilizan para etiquetar excitatorios13 e inhibitorio14 terminales presinápticos, respectivamente. En el lado postsináptico, anticuerpos contra la proteína Homer pueden ser empleados para marcar las terminales postsinápticas y anticuerpos contra densidad postsynaptic proteínas 95 (PSD95)15,16,17 o gephyrin18 , 19 , 20 puede etiquetar terminales postsinápticos excitatorios o inhibitorios, respectivamente. Mediante el uso de anticuerpos contra una proteína de interés y marcadores tales como los descritos anteriormente, uno puede determinar la localización de dicha proteína. Muchos estudios hasta la fecha han hecho esto en una forma cualitativa21. Sin embargo, determinar confiablemente la distribución diferencial de una proteína sináptica específica, uno debe no sólo determinar su presencia o ausencia sino también su concentración relativa. La heterogeneidad de tamaños y densidad de las sinapsis, es importante establecer una relación entre el marcador sináptico y la proteína de interés. De lo contrario, muestra una alta densidad de proteínas sinápticas, solamente debido a la mayor densidad de sinapsis pero no debido a una fuerte presencia de esa proteína en regiones ricas en sinapsis como las capas no piramidal del hipocampo y la capa molecular del cerebelo cada sinapsis (por ejemplo, Wallrafen y Dresbach1). Por otro lado, las proteínas en el soma neuronal (p. ej., TGN3822) generalmente presentan fuerte presencia en la capa de células piramidales hipocampales o capa de células de hipocampo o cerebelosas del gránulo debido a la alta concentración de cuerpos celulares neuronales en esas áreas. Por lo tanto, esta distribución no homogénea de las estructuras, en este caso sinapsis, puede conducir a una falsa estimación de la distribución de la proteína del interés propio. Además, hay una variabilidad intrínseca en la tinción de intensidades a través de muestras en los stainings de immunohistochemical. El protocolo descrito aquí tiene esto en cuenta y evita tales sesgos, así como otras advertencias que surgen de métodos inmunohistoquímicos.
En nuestro reciente estudio, hemos utilizado este método para describir la expresión diferencial del motor (también denominado TPRGL23 SVAP3024) a través de 16 cerebro diferentes zonas1. Es una proteína sináptica específica de vertebrados que puede encontrarse en asociación a las vesículas sinápticas e influye neurotransmisor lanzamiento25,26,27. Hemos relacionado la expresión de Mover a la abundancia de vesículas sinápticas, de coloración para el synaptophysin como un marcador de referencia de la vesícula sináptica. Se encontraron altos niveles del motor particularmente en la amígdala, los núcleos septales y el pallidum ventral. En el hipocampo, encontramos una distribución heterogénea de Mover, con altos niveles en las capas asociadas con cómputo intra-hippocampal y bajos niveles en las capas de entrada y salida.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método había presentado aquí tiene como objetivo cuantificar la distribución de una proteína de interés en relación con la abundancia de una proteína del marcador con una distribución conocida. Tinción de inmunofluorescencia puede mostrar una alta variabilidad de la coloración de intensidades entre los diferentes sectores. El enfoque de cuantificación descrito aquí evita este problema mediante la determinación de la proporción de la proteína de interés para el medio a través del hemisferio. Por lo ta…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Irmgard Weiss excelente asistencia técnica. Los autores reconocen el apoyo de Hermes Pofantis y Andoniya Petkova. Los autores también agradecen el Instituto Europeo de Neurociencias para el uso de la LSM800 y asistencia técnica, especialmente por el Dr. Nils Halbsgut. Este trabajo fue financiado por la Universidad médica centro de Göttingen. JSV agradece apoyo por el centro de microscopía de la nanoescala y Fisiología Molecular del cerebro (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
Referências
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