التحديد الكمي للتوزيع غير متجانسة من البروتين متشابك في الدماغ الماوس استخدام الفلورة
Summary
هنا، يمكننا وصف نهج كمي لتحديد توزيع البروتين متشابك بالنسبة للبروتين علامة استخدام الفلورة تلطيخ والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب.
Abstract
وجود أو عدم وجود، أو مستويات معينة من البروتينات متشابك يمكن التأثير على شدة انتقال متشابك. بالإضافة إلى توضيح وظيفة البروتين، من الضروري أيضا تحديد توزيعها. هنا، يمكننا وصف بروتوكول استخدام الفلورة والفحص المجهري [كنفوكل]، والتحليل القائم على الحاسوب لتحديد توزيع البروتين متشابك المحرك (تسمى أيضا تبرجل أو SVAP30). نحن مقارنة توزيع المحرك لأن سينابتوفيسين البروتين حويصلة متشابك، وبالتالي تحديد توزيع المحرك بطريقة كمية مقارنة بوفرة حويصلات متشابك. جدير بالذكر أن يحتمل أن يكون تنفيذ هذا الأسلوب للسماح للمقارنة بين توزيع البروتينات باستخدام الأجسام المضادة المختلفة أو المجاهر أو عبر دراسات مختلفة. لدينا طريقة تلتف تقلب الملازمة لمن ستينينجس إيمونوفلوريسسينت بالغلة بنسبة بدلاً من المستويات المطلقة الأسفار. بالإضافة إلى ذلك، يتيح الأسلوب يصف لنا الباحث لتحليل توزيع البروتين على مستويات مختلفة: من شرائح المخ كله لمناطق الدماغ لمختلف المناطق دون الإقليمية في مجال المخ واحد، مثل طبقات مختلفة من قرن آمون أو حسية كورتيسيس. المحرك هو بروتين فقاريات محددة مقترنة حويصلات متشابك. مع هذا الأسلوب، ونظهر أن المحرك هو موزعة بين مناطق الدماغ، مع مستويات عالية في المكورة البطني ونواة الحاجز في اللوزة، وأيضا داخل مناطق الدماغ واحدة، مثل طبقات مختلفة من الحصين.
Introduction
يحدث الاتصال بين الخلايا العصبية في مواقع اتصال متخصصة تسمى نقاط الاشتباك العصبي. الاشتباكات العصبية تحتوي على عدد ضخم بروتينات المختلفة التي تنسق انتقال متشابك. بعض من تلك البروتينات تظهر توزيعاً غير متجانسة في جميع أنحاء النظام العصبي وليست موجودة في كل المشبك1. مثال واحد لهذا بروتين هو Munc13، الذي يشارك في عملية فتيلة من حويصلات متشابك. وهناك isoforms مختلفة من Munc13، التي توزع في جميع أنحاء الدماغ2تقوم، ويمكن أن تؤثر على وجود أو عدم وجود isoforms محددة قصيرة الأجل اللدونة متشابك وحويصله متشابك ديناميات3، 4 , 5-لذلك، أنها ذات أهمية حيوية ليتمكن من تحديد وجود البروتينات متشابك المختلفة عبر مناطق الدماغ.
أساليب اختيار للتحديد الكمي للبروتينات متشابك-حتى الآن-هي الكتلي والغربية النشاف، بدلاً من إيمونوهيستوتشيميستري6،7،،من89. وفي بعض الحالات، يتم استخدام عدة أساليب يكمل كل منهما الآخر لتقييم الكمية وإضفاء الطابع المحلي على البروتينات المحددة (أي، فيلهلم et al. 10)-الأسلوب يصف لنا هنا يسمح للتعريب والتحديد الكمي للبروتينات للفائدة دون الحاجة إلى استخدام أي أسلوب البيوكيميائية، ببساطة استخدام ستينينجس إيمونوفلوريسسينت. هنا ميزة أخرى هي أنه يمكن أن يتم التحديد الكمي على مناطق أصغر بكثير، ولذلك أكثر تحديداً، من تلك التي تحققت بأساليب أخرى. ومع ذلك، يتعين على المرء أن يأخذ في الاعتبار ضرورة بروتين مرجع موثوق بها لتقييم توزيع بروتين الفائدة.
صبغة الفلورسنت ب immunohistochemistry يسمح لنا بتحديد إضفاء الطابع المحلي على البروتينات بصورة روتينية عبر مناطق الدماغ وكذلك داخل الأقسام العصبية المختلفة. للتعرف على الأقسام المختلفة، يتم استخدام علامات محددة. عادة، يمكن استخدام أجسام مضادة ضد سينابسين وسينابتوفيسين11 لتسمية حويصلات متشابك، بينما الأجسام المضادة ضد عزف تسمية منطقة نشطة من المحطة الطرفية presynaptic12. الناقلين حويصلية، مثل الناقلين غلوتامات حويصلية (فجلة) أو الناقل غابا حويصلية (فجأت)، تستخدم لتسمية ضادات13 و المثبطة14 محطات presynaptic، على التوالي. من ناحية بوستسينابتيك، يمكن أن تستخدم الأجسام المضادة ضد بروتين هوميروس بمناسبة بوستسينابتيك المحطات الطرفية، والأجسام المضادة ضد الكثافة بوستسينابتيك البروتين 95 (PSD95)15،،من1617 أو جيفيرين18 , 19 , ويمكن تسمية 20 محطات بوستسينابتيك ضادات أو المثبطة، على التوالي. باستخدام الأجسام المضادة ضد بروتين الفائدة وعلامات مثل تلك المذكورة أعلاه، واحد تحدد إضفاء الطابع المحلي على هذا البروتين. العديد من الدراسات لتاريخ فعلنا ذلك في طريقة نوعية21. بيد لتحديد توزيع التفاضلية بروتين متشابك محددة موثوق بها، واحدة يجب أن لا فقط تحديد وجودها أو غياب لكن تركيزه النسبي أيضا. عدم تجانس أحجام وكثافة الاشتباكات العصبية يجعل من المهم إثبات نسبة بين علامة متشابك والبروتين من الفائدة. وبخلاف ذلك، سوف تظهر المناطق الغنية بالمشبك مثل الطبقات غير الهرمية قرن آمون والطبقة الجزيئية المخيخ بكثافة عالية من البروتينات متشابك، فقط بسبب كثافة أعلى من نقاط الاشتباك العصبي ولكن ليس بسبب وجود قوي لهذا البروتين في كل المشبك (مثلاً، والرافين ودريسباتش1). من ناحية أخرى، البروتينات في سوما العصبية (مثلاً، TGN3822) سوف تظهر عادة حضور قوي في الخلية الهرمي هيبوكامبال طبقة أو طبقة الخلايا الحبيبية هيبوكامبال أو الدماغ بسبب التركيز العالي للهيئات الخلايا العصبية وفي تلك المناطق. ولذلك، هذا التوزيع غير المتجانس للهياكل، وفي هذه الحالة synapses، يمكن أن يؤدي إلى إجراء تقدير كاذبة لتوزيع البروتين الاهتمام نفسه. وعلاوة على ذلك، يوجد التغيرات جوهرية في تلطيخ كثافات عبر العينات في ستينينجس المناعي. البروتوكول هو موضح هنا يأخذ هذا في الاعتبار، ويتجنب هذه الانحيازات، فضلا عن غيرها من المحاذير التي تنشأ من أساليب المناعي.
في مؤخرا دراسة، وقد استخدمت هذا الأسلوب لوصف التعبير التفاضلية من المحرك (تسمى أيضا تبرجل23 أو24من SVAP30) عبر مناطق مختلفة من الدماغ 161. المحرك هو بروتين متشابك فقاريات محددة يمكن العثور في الرابطة إلى حويصلات متشابك ويؤثر العصبي الإفراج عن25،،من2627. نحن تتعلق بالتعبير المحرك لوفرة حويصلات متشابك، تلطيخ سينابتوفيسين كعلامة مرجعية حويصلة متشابك. وجدنا مستويات عالية للمحرك خاصة في نواة الحاجز، المكورة البطني وفي اللوزة. ضمن قرن آمون، وجدنا توزيعاً غير متجانسة من المحرك، مع مستويات عالية في الطبقات المرتبطة بعملية حسابية داخل هيبوكامبال، ومستويات منخفضة في طبقات الإدخال والإخراج.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة المعروضة هنا يهدف إلى التحديد الكمي لتوزيع بروتين فائدة بالنسبة إلى الوفرة من البروتين علامة مع توزيع معروفة. يمكن إظهار تلطيخ الفلورة تقلب عالية لتلطيخ كثافة بين شرائح مختلفة. أن النهج الكمي الموصوفة هنا تلتف هذه المشكلة بتحديد نسبة بروتين الفائدة إلى المتوسط في جميع أنحاء نصف ا…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر ارمغارد فايس للمساعدة التقنية الممتازة. الكتاب نعترف بالدعم المقدم من شركة هرمس بوفانتيس وبيتكوفا أندونييا. كما يشكر المؤلفون المعهد الأوروبي لعلم الأعصاب للاستخدام LSM800 وتقديم المساعدة التقنية، لا سيما من جانب الدكتور نيلز هالبسجوت. تم تمويل هذا العمل من “غوتينغن المركز الطبي الجامعي”. JSV يقر دعم المركز للفحص المجهري النانو والفيزيولوجيا الجزيئية للدماغ (كنمبب).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
Referências
- Wallrafen, R., Dresbach, T. The Presynaptic Protein Mover Is Differentially Expressed Across Brain Areas and Synapse Types. Frontiers in Neuroanatomy. 12, 58 (2018).
- Augustin, I., Betz, A., Herrmann, C., Jo, T., Brose, N. Differential expression of two novel Munc13 proteins in rat brain. Biochemical Journal. 337, 363-371 (1999).
- Rosenmund, C., et al. Differential Control of Vesicle Priming and Short-Term Plasticity by Munc13 Isoforms. Neuron. 33, 411-424 (2002).
- Breustedt, J., et al. Munc13-2 differentially affects hippocampal synaptic transmission and plasticity. Cerebral cortex. 20, 1109-1120 (2010).
- Chen, Z., Cooper, B., Kalla, S., Varoqueaux, F., Young, S. M. The Munc13 Proteins Differentially Regulate Readily Releasable Pool Dynamics and Calcium-Dependent Recovery at a Central Synapse. The Journal of Neuroscience. 33, 8336-8351 (2013).
- Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A Defined Methodology for Reliable Quantification of Western Blot Data. Mol Biotechnol. , (2013).
- Charette, S. J., Lambert, H., Nadeau, P. J., Landry, J. Protein quantification by chemiluminescent Western blotting Elimination of the antibody factor by dilution series and calibration curve. Journal of Immunological Methods. 353, 148-150 (2010).
- Heidebrecht, F., Heidebrecht, A., Schulz, I., Behrens, S., Bader, A. Improved semiquantitative Western blot technique with increased quantification range. Journal of Immunological Methods. 345, 40-48 (2009).
- Toki, M. I., Cecchi, F., Hembrough, T., Syrigos, K. N., Rimm, D. L. Proof of the quantitative potential of immunofluorescence by mass spectrometry. Laboratory Investigation. 97, 329-334 (2017).
- Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
- Navone, F., et al. Protein p38: An integral membrane protein specific for small vesicles of neurons and neuroendocrine cells. Journal of Cell Biology. 103, 2511-2527 (1986).
- Gundelfinger, E. D., Reissner, C., Garner, C. C. Role of Bassoon and Piccolo in Assembly and Molecular Organization of the Active Zone. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 7, (2016).
- Ziegler, D. R., Cullinan, W. E., Herman, J. P. Distribution of vesicular glutamate transporter mRNA in rat hypothalamus. Journal of Comparative Neurology. 448, 217-229 (2002).
- Chaudhry, F. A., et al. The vesicular GABA transporter, VGAT, localizes to synaptic vesicles in sets of glycinergic as well as GABAergic neurons. Journal of Neuroscience. 18, 9733-9750 (1998).
- Aoki, C., et al. Electron Microscopic Immunocytochemical SAP-97 at Postsynaptic, Presynaptic, and Nonsynaptic Sites of Adult and Neonatal Rat Visual Cortex. Synapse. 257, 239-257 (2001).
- Valtschanoff, J. G., et al. Expression of NR2 Receptor Subunit in Rat Somatic Sensory Cortex : Synaptic Distribution and Colocalization With NR1 and PSD-95. Journal of Comparative Neurology. 611, 599-611 (1999).
- Hunt, A., Schenker, L. J., Kennedy, B. PSD-95 Is Associated with the Postsynaptic Density and Not with the Presynaptic Membrane at Forebrain Synapses. Journal of Neuroscience. 76, 1380-1388 (1996).
- Luscher, B., Fuchs, T., Kilpatrick, C. L. GABA A Receptor Trafficking-Mediated Plasticity of Inhibitory Synapses. Neuron. 70, 385-409 (2011).
- Kirby, M. . Understanding the molecular diversity of GABAergic synapses. 5, 1-12 (2011).
- Harris, K. M., Weinberg, R. J., Verrall, A. W. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 1-30 (2012).
- Heise, C., et al. Selective Localization of Shanks to VGLUT1-Positive Excitatory Synapses in the Mouse Hippocampus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, (2016).
- Peters, P. J., Yuan, L. C., Biology, C., Branch, M. Localization of TGN38 to the trans-Golgi network: involvement of a cytoplasmic tyrosine-containing sequence. Journal of Cell Biology. 120, 1123-1135 (1993).
- Antonini, D., et al. Tprg, a gene predominantly expressed in skin, is a direct target of the transcription factor p63. Journal of Investigative Dermatology. 128, 1676-1685 (2008).
- Burre, J., et al. Synaptic vesicle proteins under conditions of rest and activation: Analysis by 2-D difference gel electrophoresis. Electrophoresis. 27, 3488-3496 (2006).
- Kremer, T., et al. Mover is a novel vertebrate-specific presynaptic protein with differential distribution at subsets of CNS synapses. FEBS Letters. 581, 4727-4733 (2007).
- Ahmed, S., et al. Mover Is a Homomeric Phospho-Protein Present on Synaptic Vesicles. PLoS ONE. 8, (2013).
- Körber, C., et al. Modulation of Presynaptic Release Probability by the Vertebrate-Specific Protein Mover. Neuron. 87, 521-533 (2015).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. , 1-9 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, (2012).
- Schneider Gasser, E. M., et al. Immunofluorescence in brain sections: simultaneous detection of presynaptic and postsynaptic proteins in identified neurons. Nature Protocols. 1, 1887-1897 (2006).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Sun, Y., Ip, P., Chakrabartty, A. Simple Elimination of Background Fluorescence in Formalin-Fixed Human Brain Tissue for Immunofluorescence Microscopy. Journal of Visualized Experiments. , 1-6 (2017).
- Poole, A. R., Dingle, J. T., Mallia, A. K. The localization of retinol-binding protein in rat liver by immunofluorescence microscopy. Journal of Cell Science. 394, 379-394 (1975).
