Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza
Summary
Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.
Abstract
La presenza, assenza o livelli di specifiche proteine sinaptiche possono influire gravemente trasmissione sinaptica. Oltre a chiarire la funzione di una proteina, è fondamentale per determinarne anche la distribuzione. Qui, descriviamo un protocollo che impiegano immunofluorescenza, microscopia confocale e l’analisi computerizzata per determinare la distribuzione della proteina sinaptica Mover (chiamato anche TPRGL o SVAP30). Mettiamo a confronto la distribuzione del motore a quello della sinaptofisina proteine delle vescicole sinaptiche, determinando la distribuzione del motore in maniera quantitativa rispetto l’abbondanza delle vescicole sinaptiche. In particolare, questo metodo potrebbe potenzialmente essere implementato per consentire il confronto tra la distribuzione delle proteine usando anticorpi differenti o microscopi o attraverso studi differenti. Il nostro metodo elude la variabilità inerente di immunofluorescente stainings cedendo un rapporto piuttosto che i livelli assoluti di fluorescenza. Inoltre, il metodo descriviamo consente al ricercatore di analizzare la distribuzione di una proteina su diversi livelli: dalle fette di cervello intero a regioni del cervello a subregions differenti nell’area di un cervello, come i diversi strati dell’ippocampo o sensoriali cortecce. Mover è una proteina di vertebrato-specifico che è associata con vescicole sinaptiche. Con questo metodo, dimostriamo che Mover è eterogeneo tra aree del cervello, con gli alti livelli nell’amigdala, i nuclei settali e pallidum ventrale e anche all’interno di aree cerebrali singole, ad esempio i diversi strati dell’ippocampo.
Introduction
Comunicazione tra neuroni avviene presso siti specializzati di contatto chiamati sinapsi. Sinapsi contengono una miriade di diverse proteine che orchestrano trasmissione sinaptica. Alcune di quelle proteine mostrano una distribuzione eterogenea in tutto il sistema nervoso e non sono presenti in ogni sinapsi1. Un esempio di una tal proteina è Munc13, che è coinvolto nel processo di adescamento delle vescicole sinaptiche. Esistono diverse isoforme di Munc13, che sono distribuite in modo eterogeneo in tutto il cervello2, e la presenza o l’assenza di specifiche isoforme possa influenzare la plasticità sinaptica a breve termine e dynamics delle vescicole sinaptiche3, 4 , 5. Pertanto, è di vitale importanza per essere in grado di identificare la presenza di diverse proteine sinaptiche tra aree del cervello.
I metodi di scelta per la quantificazione delle proteine sinaptiche – finora – sono di spettrometria di massa e Western blotting, piuttosto che immunohistochemistry6,7,8,9. In alcuni casi, vengono utilizzati diversi metodi per completarsi a vicenda per valutare sia la quantità e la localizzazione delle proteine specifiche (cioè, Wilhelm et al. 10). il metodo qui descritto consente per la localizzazione e la quantificazione delle proteine di interesse senza la necessità di utilizzare qualsiasi metodo di biochimica, semplicemente che impiegano gli stainings immunofluorescenti. Un altro vantaggio è che la quantificazione può essere fatto su aree molto più piccoli e, dunque, più specifico, rispetto a quelli realizzati con altri metodi. Tuttavia, uno deve prendere in considerazione che una proteina di riferimento affidabile è necessario per valutare la distribuzione della proteina di interesse.
Macchiatura fluorescente da immunohistochemistry permette di identificare sistematicamente la localizzazione delle proteine attraverso aree cerebrali, così come all’interno di diversi compartimenti neuronali. Per identificare i diversi compartimenti, vengono utilizzati gli indicatori specifici. In genere, anticorpi contro la sinapsina e lo synaptophysin11 possono essere usati per etichettare le vescicole sinaptiche, mentre gli anticorpi contro fagotto etichettare la zona attiva di un terminale presinaptico12. Trasportatori vescicolari, quali i trasportatori del glutammato vescicolare dei suini (vGluT) o il trasportatore vescicolare di GABA (vGAT), vengono utilizzati per etichettare eccitatorio13 e inibitorio14 terminali presinaptici, rispettivamente. Sul versante postsinaptico, anticorpi contro la proteina Homer possono essere impiegati per contrassegnare terminali postsinaptici e anticorpi contro densità postsinaptica proteina 95 (PSD95)15,16,17 o gephyrin18 , 19 , 20 può etichettare terminali postsinaptici eccitatori o inibitori, rispettivamente. Usando gli anticorpi contro una proteina di interesse e marcatori come quelle descritte sopra, si può determinare la localizzazione di tali proteine. Molti studi fino ad oggi hanno fatto questo in un modo qualitativo21. Tuttavia, per determinare in modo affidabile la distribuzione differenziale di una specifica proteina sinaptica, si deve non solo determinare la presenza o assenza, ma anche la concentrazione relativa. L’eterogeneità di dimensioni e densità delle sinapsi lo rende importante per stabilire un rapporto tra il marcatore sinaptico e la proteina di interesse. In caso contrario, sinapsi ricche regioni quali gli strati non-piramidali dell’ippocampo e strato molecolare del cervelletto mostrerà un’alta densità di proteine sinaptiche, solo a causa della maggiore densità delle sinapsi, ma non a causa di una forte presenza di quella proteina in ogni sinapsi (ad es., Wallrafen e Dresbach1). D’altra parte, proteine in soma neuronale (ad es., TGN3822) di solito mostrano forte presenza nella strato delle cellule piramidali hippocampal o strato delle cellule ippocampali o cerebellari del granello dovuta all’alta concentrazione di corpi delle cellule neuronali in quelle zone. Pertanto, questa distribuzione non omogenea delle strutture, in questo caso le sinapsi, può portare a una falsa stima della distribuzione della proteina di interesse stesso. Inoltre, vi è un’intrinseca variabilità nell’intensità di colorazione attraverso campioni in stainings immunohistochemical. Il protocollo descritto qui prende questo in considerazione ed evita tali pregiudizi, come pure altri avvertimenti che derivano da metodi immunohistochemical.
Nel nostro recente studio, abbiamo utilizzato questo metodo per descrivere l’espressione differenziale di Mover (chiamato anche TPRGL23 o SVAP3024) attraverso 16 di aree differenti del cervello1. Mover è una proteina sinaptica di vertebrato-specifico che può essere trovata in associazione a vescicole sinaptiche ed influenze neurotrasmettitore rilascio25,26,27. Abbiamo abbiamo riferito l’espressione Mover per l’abbondanza delle vescicole sinaptiche, macchiando per lo synaptophysin come un marcatore di riferimento delle vescicole sinaptiche. Abbiamo trovato alti livelli di Mover in particolare i nuclei settali, pallidum ventrale e l’amigdala. All’interno dell’ippocampo, abbiamo trovato una distribuzione eterogenea di Mover, con alti livelli negli strati connessi con calcolo intra-ippocampale e bassi livelli in livelli di ingresso e di uscita.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo qui presentato mira a quantificare la distribuzione di una proteina di interesse riguardante l’abbondanza di una proteina marker con una nota distribuzione. Colorazione di immunofluorescenza può mostrare un’alta variabilità dell’intensità tra le diverse sezioni di colorazione. L’approccio di quantificazione descritto qui aggira questo problema determinando il rapporto della proteina di interesse per i media in tutto l’emisfero. Di conseguenza, diverse intensità di colorazione attraverso fette sono vanificat…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Irmgard Weiss per l’eccellente assistenza tecnica. Gli autori riconoscono supporto da Hermes Pofantis e Andoniya Petkova. Gli autori ringraziano anche l’Istituto europeo di Neuroscienze per l’utilizzo del LSM800 e assistenza tecnica, soprattutto da Dr. Nils Halbsgut. Questo lavoro è stato finanziato all’University Medical Center Gottinga. JSV riconosce sostegno dal centro per microscopia su scala nanometrica e fisiologia molecolare del cervello (CNMPB).
Materials
| 1.5 mL reaction tubes | Eppendorf | 30120094 | |
| 50 mL reaction tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| multiwell 24 well | Fisher Scientific | 087721H | |
| plastic pipette (disposable) | Sarstedt | 861,176 | |
| 1000 mL pipette | Rainin | 17014382 | |
| 2 ml pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| Vortex Genius 3 | IKA | 3340001 | |
| Menzel microscope slides | Fisher Scientific | 10144633CF | |
| Stereoscope | Leica | ||
| LSM800 | Zeiss | Confocal microscope | |
| freezing microtome | Leica | ||
| PBS (10X) | Roche | 11666789001 | |
| PFA | Sigma | P6148-1kg | |
| NaCl | BioFroxx | 1394KG001 | |
| sucrose | neoFroxx | 1104KG001 | |
| Tissue Tek | Sakura | 4583 | OCT |
| Na2HPO4 | BioFroxx | 5155KG001 | |
| NaH2PO4 | Merck | 1,063,460,500 | |
| normal goat serum | Merck Millipore | S26-100ML | |
| normal donkey serum | Merck | S30-100ML | |
| Triton X-100 | Merck | 1,086,031,000 | |
| rabbit anti-Mover | Synaptic Systems | RRID: AB_10804285 | |
| guinea pig anti-Synaptophysin | Synaptic Systems | RRID: AB_1210382 | |
| donkey anti-rabbit AF647 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2492288 | |
| goat anti-mouse AF488 | Jackson ImmunoResearch | RRID: AB_2337438 | |
| Mowiol4-88 | Calbiochem | 475904 | |
| ZEN2 blue software | Zeiss | Microscopy software | |
| FIJI | ImageJ | Analysis software | |
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
Referências
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