Vitro analyser att utvärdera migreringen, Invasion och spridning av förevigade mänskliga första trimestern trofoblaster cellinjer
Summary
Här presenterar vi ett mycket lättillgänglig protokoll för att utvärdera cell rörelsen i mänskliga trofoblaster celler med tre in vitro-analyser: scratch analysen, transwell invasion analysen och den cell proliferation assay.
Abstract
Cellers rörelser är en viktig egenskap för trofoblaster under placenta utveckling och tidig graviditet. Betydelsen av korrekt trofoblaster migration och invasion framgår av graviditet störningar såsom preeklampsi och intrauterin tillväxt begränsning, som är förknippade med otillräcklig trofoblaster invasion av den maternella kärlsystemet. Tyvärr, vår förståelse av mekanismerna som moderkakan utvecklas från att migrera trofoblaster är begränsad. In vitro-analys av cellmigration via scratch analysen är ett användbart verktyg för att identifiera faktorer som reglerar trofoblaster flyttande kapacitet. Denna analys ensam definierar dock inte de cellförändringar som kan leda till förändrad cellmigration. Det här protokollet beskriver tre olika in vitro-analyser som används gemensamt utvärdera trofoblaster cell rörelse: scratch analysen, invasion analysen och spridningen analysen. De protokoll som beskrivs här kan också ändras för användning i andra cellinjer att kvantifiera cellers rörelser som svar på stimuli. Dessa metoder kan utredarna att identifiera individuella faktorer som bidrar till den cell rörligheten och ger en grundlig undersökning av potentiella mekanismerna bakom synbara förändringar i cellmigration.
Introduction
Placenta utveckling är ett avgörande steg i etableringen av graviditet, påverkar både moderns och fostrets hälsa. Den mekanistiska grunden genom vilket detta sker är dock inte helt klarlagt. Cellmigration är en viktig biologisk process som bidrar till upprättande och funktioner av moderkakan under graviditet. Efter blastocysten implantation, trophectoderm gör åtskillnad mellan in i villösa trofoblaster, som täcka ytan av de chorionic tarmludd och är involverade i gas och näringsämnen exchange, och extravillous trofoblaster (vilket), som vandrar ut från villina och invadera maternell decidua och kärlsystemet1. Migrering av vilket är viktigt för remodeling maternell spiral artärer och upprätta uteroplacentalt omsättning för att stödja fostrets tillväxt2. Otillräcklig trofoblaster invasionen under graviditeten resulterar i onormal placenta utveckling och kan bidra till graviditetskomplikationer som havandeskapsförgiftning, graviditetsdiabetes hypertoni, intrauterin tillväxt begränsning och prematur förlossning3, 4. Det är därför nödvändigt att fastställa de vägar som krävs för normal placentation förstå de faktorer som påverkar trofoblaster motilitet.
Trofoblaster migration styrs av ett komplext nätverk av signalmolekyler, inklusive angiogena faktorer5, hormoner, tillväxtfaktorer och cytokiner. På grund av begränsningarna av att studera moderkakan i vivo, förevigade in vitro-analyser utnyttja mänskliga trofoblaster cell linjer har varit avgörande att identifiera faktorer som bidrar till trofoblaster motilitet. Skrapa och invasion analyser har använts i stor utsträckning att kvantitativt bedöma rollen av enskilda molekyler på trofoblaster cell migration6,7,8. Men medan användbar tillsammans för att undersöka hur förändringar i migration kan orsakas av förändringar i cell invasivitet, dessa två analyser inte hänsyn till ytterligare mekanismer som kan bidra till förändrad priser av cellmigration. Minskningar av andelen cellproliferation kan exempelvis resultera i färre celler tillgängliga för migrering.
Här beskriver vi kvantitativa in vitro-metoder för att bedöma trofoblaster migrering med scratch, cellproliferation och cell invasion analyser. Ett enhetligt sår skapas i en cell enskiktslager i scratch-analysen, och migration av celler för att fylla gapet mäts genom automatiserad, time-lapse avbildning av såret storlek och täthet av celler i såret. Cell spridning analysen baseras på beräkning av förhållandet mellan celler vid varje tidpunkt jämfört med en känd start mängd celler. Celler är seedade ovanpå en extracellulär matrix-belagd cell kultur infoga kammare (e.g. Transwell) i cell invasion analysen, och antalet celler som invaderar genom den extracellular matrisen svar på kemo-lockmedel räknas.
Scratch analysen är ett enkelt och effektivt verktyg som kan användas för att avgöra hur olika miljöförhållanden påverka cellmigration. Spridning och invasion analyserna kan därefter användas för att bestämma cellproliferation och invasivitet till övergripande förändringar i cellmigration bidrag. Tillsammans, ger dessa analyser robust mätningar av biologiska processer som kan bidra till cell motilitet. Två förevigade första trimestern trofoblaster cellinjer användes i beskrivs analyser, Swan.71 (Sw.71) och HTR-8/SVneo9,10. Dessa analyser kan dock också vara optimerad för användning i andra celltyper att identifiera viktiga modulatorer av cellmigration och invasion.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta förfarande bygger på användning av migration och invasion analyser att omfatta graden av cellproliferation som potentiella bidragsgivare att uppmätta skillnader i trofoblaster cellers rörelser. Används tillsammans, är dessa in vitro-testmetoder enkla och effektiva metoder som kan användas för att identifiera de cellulära vägar som reglerar trofoblaster migration. Som beskrivits ovan, kan trofoblaster celler behandlas med hormoner, cytokiner, tillväxtfaktorer eller andra molekyler att bestämma deras inv…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Dr Gil Mor för att tillhandahålla de Sw.71 cellerna. Denna forskning stöddes av en Albert McKern Scholar Award till S.V.
Materials
| 0.4% Trypan blue stain | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| 1.0 M HEPES | AmericanBio | AB06021-00100 | |
| 10 mM MEM non-essential amino acids | Life Technologies | 11140-050 | |
| 100 mM sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-070 | |
| 24-well plate transwell inserts | Corning | 3422 | Contain polycarbonate filters with an 8 μm pore size |
| Charcoal dextran-stripped FBS | Gemini Bio-Products | 100-119 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Crystal Violet | Sigma Aldrich | C0775 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Fisher Scientific | 8310-4 | |
| Dexamethasone (Dex; 1, 4-pregnadien-9α-fluoro-16α-methyl-11β, 17, 21-triol-3, 20-dione; ≥98% TLC) | Steraloids | P0500-000 | |
| DMEM/Ham’s F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F2442 | |
| IncuCyte 24-well ImageLock Plates | Essen BioScience | 4365 | If using the IncuCyte Zoom imaging system, seed cells onto IncuCyte ImageLock Plates. These plates have fiducial markers on the bottom of the plate that are used as a reference for repeat imaging in a constant field of view. |
| IncuCyte software | Essen BioScience | 2010A Rev2 | |
| IncuCyte ZOOM system | Essen BioScience | N/A | Scratch assay images were captured and analyzed using the preset “Scratch Wound” parameters on the IncuCyte ZOOM system. Other time-lapse microscopes may also be used. |
| Matrigel Membrane Matrix | Becton Dickinson | 356231 | Growth factor reduced, phenol-red free |
| Micro Slides | VWR International, LLC | 48311-7003 | |
| Microscope cover glass | Fisher Scientific | 12-545-E | |
| Olympus IX71 inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Penicillin (10,000 units/mL)/streptomycin (10,000 µg/mL) | Life Technologies | 151-40-122 | |
| Phenol-red free DMEM/Ham's F12 | Life Technologies | 11039-021 | |
| Semi-automatic wound maker tool | Essen BioScience | N/A |
Referências
- Ji, L., et al. Placental trophoblast cell differentiation: Physiological regulation and pathological relevance to preeclampsia. Molecular Aspects of Medicine. 34 (5), 981-1023 (2013).
- Caniggia, I., Winter, J., Lye, S., Post, M. Oxygen and placental development during the first trimester: implications for the pathophysiology of pre-eclampsia. Placenta. 21, S25-S30 (2000).
- Norwitz, E. R. Defective implantation and placentation: laying the blueprint for pregnancy complications. Reproductive Biomedicine Online. 13 (4), 591-599 (2006).
- Ness, R. B., Sibai, B. M. Shared and disparate components of the pathophysiologies of fetal growth restriction and preeclampsia. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 195 (1), 40-49 (2006).
- Knöfler, M. Critical growth factors and signalling pathways controlling human trophoblast invasion. The International Journal of Developmental Biology. 54 (2-3), 269-280 (2010).
- Huber, A. V., Saleh, L., Bauer, S., Husslein, P., Knöfler, M. TNFα-Mediated Induction of PAI-1 Restricts Invasion of HTR-8/SVneo Trophoblast Cells. Placenta. 27 (2), 127-136 (2006).
- Nadeem, L., et al. Nodal Signals through Activin Receptor-Like Kinase 7 to Inhibit Trophoblast Migration and Invasion. The American Journal of Pathology. 178 (3), 1177-1189 (2011).
- Onogi, A., et al. Hypoxia inhibits invasion of extravillous trophoblast cells through reduction of matrix metalloproteinase (MMP)-2 activation in the early first trimester of human pregnancy. Placenta. 32 (9), 665-670 (2011).
- Straszewski-Chavez, S. L., et al. The isolation and characterization of a novel telomerase immortalized first trimester trophoblast cell line, Swan 71. Placenta. 30 (11), 939-948 (2009).
- Graham, C. H., et al. Establishment and characterization of first trimester human trophoblast cells with extended lifespan. Experimental Cell Research. 206 (2), 204-211 (1993).
- Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Kisanga, E. P., Tang, Z., Guller, S., Whirledge, S. Glucocorticoid signaling regulates cell invasion and migration in the human first-trimester trophoblast cell line Sw. 71. American Journal of Reproductive Immunology. , e12974 (2018).
- Berthois, Y., Katzenellenbogen, J. A., Katzenellenbogen, B. S. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (8), 2496-2500 (1986).
- Cummings, B. S., Schnellmann, R. G. Measurement of cell death in mammalian cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2004).
