Zebrafisk (Danio rerio) er ved at blive en meget udbredt hvirveldyr dyr model for mikrobiel kolonisering og patogenese. Denne protokol beskriver brugen af protozo Paramecium caudatum som et redskab til fødevarebåren infektion i zebrafisk larver. P. caudatum let internalizes bakterier og få taget af larve zebrafisk gennem naturlig preying adfærd.
På grund af deres åbenhed, genetiske sporbarhed og nem vedligeholdelse zebrafisk (Danio rerio) er blevet et meget udbredt hvirveldyr model for smitsomme sygdomme. Larve zebrafisk naturligt bytte på den encellede protozo Paramecium caudatum. Denne protokol beskriver brugen af P. caudatum som et redskab til fødevarebåren infektion i larve zebrafisk. P. caudatum internalisere en bred vifte af bakterier og bakterieceller forblive levedygtige i flere timer. Zebrafisk derefter bytte om P. caudatum, den bakteriemængde er udgivet i foregut ved fordøjelse af køretøjets paramecium og bakterier kolonisere tarmkanalen. Protokollen indeholder en detaljeret beskrivelse af paramecia vedligeholdelse, indlæsning af med bakterier, bestemmelse af bakteriel nedbrydning og dosis, samt infektion af zebrafisk ved at fodre med paramecia. Fordelen ved at bruge denne metode til fødevarebåren infektion er, at det nøje efterligner tilstanden af infektion observeres i human sygdom, fører til mere robust kolonisering i forhold til fordybelse protokoller, og giver mulighed for undersøgelse af en bred vifte af patogener. Fødevarebåren infektion i zebrafisk model kan bruges til at undersøge bakterielt gen udtryk inden for den vært, vært-patogen interaktioner og kendetegnende for sygdomsfremkaldende evne herunder bakteriel byrde, lokalisering, formidling og sygelighed.
Zebrafisk andel morfologisk og funktionelt bevaret egenskaber hos pattedyr, herunder granulocytic slægter (fx neutrofiler), monocyt/makrofag-lignende celler, Toll-lignende receptorer, pro-inflammatoriske cytokiner og antimikrobielle peptider1 . Tarmkanalen i zebrafisk er fuldt udviklet på 6 dage post befrugtning (dpf) og viser morfologiske og funktionelt bevarelse med pattedyr af mave-tarmkanalen, som bevarede transkriptionel regulering i tarm epitelceller 2. Dette gør zebrafisk en fremragende model for intestinal mikrobiel kolonisering og patogenese. En bred vifte af entero mikrober er blevet undersøgt i zebrafisk model, herunder enterohemorrhagic Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, den zebrafisk mikrobiota7,8, og rollen af probiotika i tarm immunitet9. En klar fordel af zebrafisk model er, at det er koloniseret af mange mikrober uden at forstyrre den endogene mikrobiota, som giver mulighed for undersøgelse af mikrobielle adfærd i forbindelse med blandet mikrobielle populationer3, 6. i øjeblikket, de fleste zebrafisk modeller af gastrointestinale kolonisering og sygdom stole på administrationen af mikrober af Bad fordybelse, hvor zebrafisk inkuberes i en bakteriel suspension til et bestemt beløb af tid10. Dette gør det vanskeligt at bestemme den nøjagtige dosis af bakterier administreres og fører til begrænset kolonisering med nogle mikrober, særligt med ikke-sygdomsfremkaldende bakterier. Alternativt, en bakteriel suspension administreres for at fiske via mundtlige sonde11, men dette er teknisk udfordrende og begrænset til ældre larver og voksne fisk.
Denne protokol beskriver brugen af de encellede protozo Paramecium caudatum som et køretøj til fødevarebårne levering af mikrober til mave-tarmkanalen af zebrafisk larver. Paramecia er nemt og billigt at vedligeholde og er i stand til at fodre på en bred vifte af mikrober, herunder alger, svampe og bakterier, som de internalisere gennem en ciliated mundtlige groove12,13,14. Når internaliseret, bakterier holdes i vacuoles, er som i sidste ende surt og indhold forringet over en tidsramme på flere timer15. Larve zebrafisk fange paramecia som naturlige byttedyr snart efter udklækningen, omkring 3-4 dpf afhængig af temperatur16, og fylder dem med høj effektivitet. Bytte capture tager på gennemsnit 1.2 s fra registrering til at fange17, og erobrede paramecia fordøjes hurtigt i zebrafisk foregut, således at internaliseret levedygtige bakterier er udgivet i tarmkanalen3. Som et resultat, kan paramecia bruges som en hurtig og nem metode til at levere et højt og ensartet dosis af bakterier i mave-tarmkanalen af zebrafisk. De leverede bakterier kan enten blive omdannet til at udtrykke en fluorescerende proteiner, såsom mCherry, som beskrevet her, eller i tilfælde af genetisk genstridig bakterier, kan de være pre farves med et fluorescerende farvestof at tillade visualisering inden for den mave-tarmkanalen.
Denne protokol beskriver fødevarebårne levering af enteropathogenic E. coli (enterohemorrhagic E. coli [EHEC] og vedhængende invasive E. coli [AIEC]), og Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Både sygdomsfremkaldende E. coli og S. typhimurium er overført via fækal-oral rute18,19, og kan være erhvervet via forurenede fødevarer, såsom kød, grøntsager og mejeriprodukter. Ved hjælp af P. caudatum som et køretøj, kolonisere E. coli og S. typhimurium held zebrafisk larverne indenfor 30 – 60 min co inkubation med køretøjets paramecium. Den opnåede bakterielle byrde er robuste nok til at visualisere kolonisering og bestemme byrde ved plettering væv homogeniseret.
Grundlæggende protokollen beskrevet her er blevet optimeret til sygdomsfremkaldende E. coli, og er blevet med held tilpasset for andre bakteriearter, herunder Salmonella enterica og Vibrio cholerae. For nogle arter, der ikke koloniser zebrafisk tarmen efter bad fordybelse, herunder nogle Salmonella enterica stammer og nogle anaerober kan fødevarebåren infektion som beskrevet her bruges til at etablere vellykket kolonisering. I forhold til microgavage, der bruges også til at etablere høj bakteriel byrder i larve tarmkanalen, fødevarebåren infektion er teknisk mindre udfordrende og kræver mindre specialiseret udstyr. Imidlertid skal kritiske parametre optimeres for de bakteriearter og stammer skal anvendes. Disse faktorer omfatter bakteriel og paramecium tæthed for bakterier-paramecium Co kultur trin: Hvis bakteriel numre inden for paramecia er lav, dette kunne forbedres ved at øge den bakterielle tæthed taktfast Co kultur. Nogle bakteriearter kan forårsage skade på paramecium vært, og dette bør vurderes ved mikroskopi.
En anden vigtig faktor i denne protokol er bytte opsamling af zebrafisk. Den preying sats er som beskrevet her baseret på den antagelse, at hver bytte capture strike resultater i indtagelse af et paramecium. Høje tætheder af paramecia pr. fisk bruges i protokollen til at sikre høj preying priser. Dog bytte capture er afhængig af tæthed af paramecia i systemet, og i meget fortyndet paramecium kulturer, preying priser kan være så lav som 13 – 15 paramecia pr. time21,22. En begrænsning er at bytte fange satser er også stærkt afhængig af lysforhold og i mørke, fange satser er 80% lavere end i lysforhold21 , og dette bør tages i betragtning ved opsætning af eksperimenter. Hvis eksponering gange at bytte skal udvides til at optimere kolonisering, har overvejelser skal gives til sekundær eksponering for bakterier gennem afføring. På betingelser beskrevet ovenfor – 2 h af bytte eksponering – er denne eksponering ubetydelig, da gut passage tid af bakterier er mere end 1 h og koncentrationen af bakterier i køretøjet er meget højere end i afføring. Men hvis bytte eksponeringstid er steget betydeligt, kan dette blive en væsentlig faktor.
Passende kontrol bør indgå i denne protokol, herunder kolonisering af zebrafisk efter fodring med paramecia som indeholder ikke-sygdomsfremkaldende E. coli MG1655. Hvis flere bakteriestammer er i forhold til deres evne til at kolonisere zebrafisk værten, er det vigtigt at teste, om deres halveringstiden i paramecia er sammenlignelige. Bakteriel mutationer, herunder at kompromittere cellevæg integritet eller syre sensing, kan kompromittere bakteriel stabilitet inden for paramecia. I sådanne tilfælde har zebrafisk fodring tilpasses at tage højde for forskelle i doseringen.
Protokollen beskrevet her kan bruges til at undersøge bakteriel kolonisering og konsekvenserne heraf, herunder af imaging bakteriel kolonisering af zebrafisk som beskrevet ovenfor, samt ved at bestemme CFU pr. zebrafisk fra væv homogenatet3, eller undersøge infektion-associerede sygelighed og dødelighed. Ideelt, for bakteriel visualisering, bakteriestammer udtrykker fluorescerende proteiner som mCherry eller rødt fluorescerende proteiner (RFP) bør anvendes. Dette vil tillade visualisering af voksende bakteriel populationer. Hvis den bakterielle stamme er ikke genetisk tractable eller brug ekspression af fluorescerende proteiner er udelukket af andre grunde, kan bakterier være farvet med et fluorescerende farvestof, som FM 4-64FX, forud for Co kultur med paramecia. Når du bruger protokollen beskrevet her, fælles kultur med paramecia mindske ikke lysstyrken af farvestoffet og farvede bakterier er klart synlig i zebrafisk tarmen. Farvestoffet vil dog fortyndes med tiden bør betydelig bakteriel spredning sker inden for zebrafisk vært. I begge tilfælde er rødt-fluorescerende bakterier at foretrække over grønt-fluorescerende bakterier, da væv autofluorescence kan være højere i grønne end i den røde kanal.
Det er blevet konstateret, at denne protokol kan tilpasses for aerobe og microaerophilic bakteriearter. Det kan være muligt at tilpasse det til fodring af sporer og svampe arter, selv om dette stadig afprøves eksperimentelt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af gruppen Krachler for kritisk læsning og kommentarer på manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af en UT systemer STAR award, BBSRC og NIH (R01AI132354).
Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
hemocytometer or cell counter | any | ||
stereomicroscope | any | ||
table-top centrifuge | |||
microwave | |||
rotator wheel | |||
heated shaking incubator | |||
aquatics facilities | |||
breeding tanks |