Sebrafisk (Danio rerio) blir en brukte vertebrate dyr modell for mikrobiell kolonisering og patogenesen. Denne protokollen beskriver bruken av protozoan Paramecium caudatum som et redskap for matbårne infeksjon i sebrafisk larver. P. caudatum lett internalizes bakterier og bli tatt opp av larver sebrafisk gjennom naturlig utnytter atferd.
På grunn av deres åpenhet, genetisk tractability og enkelt vedlikehold, sebrafisk (Danio rerio) har blitt en brukte virveldyr modell for infeksjonssykdommer. Larver sebrafisk naturlig tære på den encellede protozoan Paramecium caudatum. Denne protokollen beskriver bruken av P. caudatum som et redskap for matbårne infeksjon i larver sebrafisk. P. caudatum internalisere et bredt spekter av bakterier og bakterielle celler være levedyktig i flere timer. Sebrafisk deretter tære på P. caudatum, bakterielle belastningen er utgitt i foregut på fordøyelsen av paramecium bilen og bakterier kolonisere tarmkanalen. Protokollen inneholder en detaljert beskrivelse av paramecia vedlikehold, lasting bakterier, bestemmelse av bakteriell fornedrelse og dose og infeksjon i sebrafisk ved å fôre med paramecia. Fordelen av benytter denne metoden for matbårne infeksjon er at det tett etterligner infeksjon i menneskelig sykdom-modusen fører til mer robust kolonisering sammenliknet med fordypning protokoller og lar studiet av et bredt spekter av patogener. Mat-borne infeksjon i sebrafisk modell kan brukes til å undersøke bakteriell genuttrykk i vert, vert-patogen interaksjoner og kjennetegner virusets inkludert bakteriell byrden, lokalisering, formidling og sykelighet.
Sebrafisk del morphologically og funksjonelt bevart funksjoner med pattedyr, inkludert granulocytic linjene (f.eks nøytrofile), monocytt/macrophage-lignende celler, Toll-like reseptorer, pro-inflammatoriske cytokiner og antimikrobielle peptider1 . Tarmkanalen i sebrafisk er fullt utviklet ved 6 dager innlegget befruktning (dpf) og viser morfologiske og funksjonelle bevaring med pattedyr mage-tarmkanalen, som bevarte transcriptional regulering i intestinal epitelceller 2. Dette gjør sebrafisk en utmerket modell for intestinal mikrobiell kolonisering og patogenesen. En rekke enteric mikrober har vært studert i sebrafisk modell, inkludert enterohemorrhagiske Escherichia coli3, Vibrio cholerae4,5, Salmonella enterica6, den sebrafisk bakterieflora7,8, og rollen som probiotika i intestinal immunitet9. En klar fordel av sebrafisk modell er at den er ferdig kolonisert av mange uten å forstyrre den endogene bakterieflora, som gjør etterforskningen av mikrobielle atferd i forbindelse med blandet mikrobielle populasjoner3, 6. for tiden de fleste sebrafisk modeller av gastrointestinal kolonisering og sykdom avhengige av mikrober ved bad nedsenkning, der sebrafisk er ruges i en bakteriell suspensjon for en bestemt tid10. Men dette gjør det vanskelig å fastslå den eksakte dosen av bakterier administrert og fører til begrenset kolonisering med noen mikrober, spesielt med ikke-patogene bakterier. Eventuelt en bakteriell suspensjon administreres fiske via muntlig gavage11, men dette er teknisk utfordrende og eldre larver og voksne fisk.
Denne protokollen beskriver bruken av den encellede protozoan Paramecium caudatum som et redskap for matbårne levering av mikrober til fordøyelsessystemet av sebrafisk larver. Paramecia er enkelt og billig å vedlikeholde og er i stand til fôring på en rekke mikrober, inkludert alger, sopp og bakterier, som de internalisere gjennom en tungeformet muntlig groove12,13,14. En gang internalisert, bakterier er holdt i vacuoles, er som til slutt syre og innholdet degradert over en periode på flere timer15. Larver sebrafisk fange paramecia som naturlig byttedyr snart etter klekking rundt 3-4 dpf avhengig av temperaturen16, og ta dem opp med høy effektivitet. Prosessen med byttedyr fange tar på gjennomsnittlig 1.2 s fra oppdagelsen å fange17, og fanget paramecia er raskt fordøyd i sebrafisk-foregut slik at internalisert levedyktig bakterier slippes tarmkanalen3. Paramecia kan resultatet brukes som en rask og enkel metode for å levere en høy og jevn dose av bakterier inn i gastrointestinal spor av sebrafisk. Leverte bakterier kan enten bli transformert til å uttrykke en fluorescerende protein, som mCherry som beskrives her, eller ved genetisk uløselige bakterier, de kan være pre beiset med et fluorescerende fargestoff tillate visualisering i den mage-tarmkanalen.
Denne protokollen beskriver matbårne levering av enteropathogenic E. coli (enterohemorrhagiske E. coli [EHEC] og tilhenger invasiv E. coli [AIEC]), og Salmonella enterica ssp. Typhimurium. Både patogene E. coli og S. typhimurium overføres via fecal-muntlige rute18,19, og kan være ervervet via forurenset mat, som kjøtt, grønnsaker og meieriprodukter. Bruke P. caudatum som et kjøretøy, kolonisere E. coli og S. typhimurium vellykket sebrafisk Larvene innen 30-60 min med co inkubering med paramecium bilen. Oppnådd bakterielle belastningen er robuste nok til å visualisere kolonisering og bestemme byrden ved plating vev homogenates.
Grunnleggende protokollen beskrevet her er optimalisert for patogene E. coli, og har vært vellykket tilpasset andre bakterielle arter, inkludert Salmonella enterica og Vibrio cholerae. For enkelte arter som ikke kan kolonisere sebrafisk tarmen etter bad nedsenkning, inkludert noen Salmonella enterica stammer og noen anaerobes, kan matbårne infeksjon som beskrevet her brukes til å lykkes med å etablere kolonisering. Sammenlignet med microgavage, som også brukes til å opprette høy bakteriell byrder i larver tarmkanalen, matbårne infeksjon er teknisk mindre utfordrende og krever mindre spesialisert utstyr. Men skal kritiske parametere være optimalisert for bakterie-art og stammer skal brukes. Slike faktorer omfatter bakteriell og paramecium tetthet for bakterier-paramecium co kultur trinn: om bakteriell tall innenfor paramecia er lav, dette kan forbedres ved å øke bakteriell tettheten i co kultur trinn. Noen bakteriell arter kan forårsake skade på paramecium verten, og dette bør vurderes av mikroskopi.
En annen viktig faktor i denne protokollen er byttedyr fangst av sebrafisk. Utnytter hastigheten er som beskrevet her basert på antagelsen om at hver byttedyr fange strike resultater i inntak av en paramecium. Høye tettheter av paramecia per fisk brukes i protokollen for å sikre høy utnytter priser. Imidlertid byttedyr fangst er avhengig av tettheten av paramecia i systemet, og i svært fortynne paramecium kulturer, utnytter priser kan være så lite som 13-15 paramecia per time21,22. En begrensning er at byttedyr fangst priser er også sterkt avhengig av lysforholdene og i mørket, fangst priser er 80% lavere enn i lys21 og dette bør tas i betraktning når du setter opp eksperimenter. Hvis eksponeringstider å bytte må utvides til å optimalisere kolonisering, må vurdering gis til sekundære eksponering for bakterier gjennom avføring. Under forholdene beskrevet ovenfor-2 h byttedyr eksponering-er denne eksponeringen ubetydelig, siden gut passeringstider av bakterier er mer enn 1 h og konsentrasjonen av bakterier i kjøretøyet er mye høyere enn i avføring. Men hvis byttedyr eksponeringstid økes betydelig, kan dette bli en betydelig faktor.
Egnede kontroller skal inkluderes i denne protokollen, inkludert kolonisering av sebrafisk etter fôring med paramecia som inneholder ikke-patogene E. coli MG1655. Hvis flere bakteriell stammer sammenlignes for deres evne til å kolonisere sebrafisk verten, er det viktig å teste om deres half-life i paramecia sammenlignes. Bakteriell mutasjoner, inkludert de akkord cellevegg integritet eller syre sensing, kan kompromittere bakteriell stabilitet i paramecia. I slike tilfeller har sebrafisk fôring justeres kontoen for forskjellene i dosering.
Protokollen beskrevet her kan brukes til å undersøke bakteriell kolonisering og dens konsekvenser, herunder imaging bakteriell kolonisering av sebrafisk som beskrevet ovenfor og bestemme CFU per sebrafisk fra vev homogenate3, eller undersøker infeksjon-assosiert sykelighet og dødelighet. Ideelt for bakteriell visualisering, skal bakteriell stammer uttrykke fluorescerende proteiner som mCherry eller rød fluorescerende protein (RFP) brukes. Dette vil tillate visualisering av voksende bakteriell befolkninger. Hvis bakterielle belastningen er ikke genetisk medgjørlig eller bruk av fluorescerende protein uttrykk er utelukket av andre grunner, kan bakterier være farget med et fluorescerende fargestoff, som FM 4-64FX, før co kultur med paramecia. Når du bruker protokollen beskrevet her, co kultur med paramecia redusere ikke lysstyrken i fargen og farget bakterier er synlig i sebrafisk tarmen. Imidlertid vil fargestoff bli utvannet over tid bør betydelig bakteriell spredning skje innen sebrafisk verten. Uansett er rød-selvlysende bakterier å foretrekke over green-selvlysende bakterier, siden vev autofluorescence kan være høyere i grønne enn i den røde kanalen.
Det har blitt funnet at denne protokollen kan tilpasses for aerobic og gram-negative bakterie-art. Det kan være mulig å tilpasse den for fôring av sporer og fungal arter, selv om dette gjenstår å bli testet eksperimentelt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke medlemmer av gruppen Krachler for kritisk lesing og kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av en UT systemer STAR award, BBSRC og NIH (R01AI132354).
Paramecium caudatum, live | Carolina | 131554 | no not store growing cultures below room temperature |
0.4% Trypan Blue Solution | Sigma | T8154-20ML | liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture; prepared in 0.81% sodium chloride and 0.06% potassium phosphate, dibasic |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | 276855-100ML | store in a solvent safety cabinet |
Escherichia coli, MG1655 | ATCC | ATCC 700926 | can be replaced by any other non-pathogenic E. coli strain |
FM 4-64FX stain | Thermo Fisher | F34653 | aliquot and store frozen |
Formaldehyde | Sigma | F8775-4X25ML | |
LB Broth | Sigma | L3397-1KG | |
Phosphate buffered saline tablets | Thermo Fisher | 18912014 | |
Tetracycline | Sigma | 87128-25G | toxic, irritant |
Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma | E10521-10G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-100ML | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Sigma | 93595-50ML | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Thermo Fisher | 16520050 | |
hemocytometer or cell counter | any | ||
stereomicroscope | any | ||
table-top centrifuge | |||
microwave | |||
rotator wheel | |||
heated shaking incubator | |||
aquatics facilities | |||
breeding tanks |