Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase
Summary
Här beskriver vi ett protokoll för en allmän puls-chase-metod som tillåter den kinetiska analysen av vikning, transport och nedbrytning av proteiner som skall följas i levande celler.
Abstract
Radioaktiva puls-chase märkning är ett kraftfullt verktyg för att studera den konfirmerande mognaden, transport till deras funktionella cellulära plats och nedbrytningen av målet proteiner i levande celler. Genom att använda kort (puls) radiolabeling gånger (< 30 min) och hårt kontrollerad chase gånger, det är möjligt att märka endast en bråkdel av den totala protein poolen och följa dess vikning. Kombination med nonreducing eller minska SDS-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE) och immunoprecipitation med (konformation-specifik) antikroppar, kan fällbara processer undersökas i detalj. Detta system har använts för att analysera den vikningen av proteiner med en stor variation i egenskaper såsom lösliga proteiner, enkel- och multi-pass transmembrana proteiner, tungt N – och O-glykosylerad proteiner och proteiner med och utan omfattande disulfid limning. Puls-chase metoder är grunden för kinetiska studier i en rad ytterligare funktioner, inklusive co – och posttranslationalen modifieringar, oligomerisering och polymerisation, i huvudsak tillåter analys av ett protein från födseln till döden. Puls-chase studier på proteinveckning kompletterar med andra biokemiska och biofysikaliska metoder för att studera proteiner i vitro genom att ge ökad temporal upplösning och fysiologisk information. Metoderna som beskrivs i detta dokument anpassas lätt för att studera den vikningen av nästan något protein som kan uttryckas i däggdjur eller insekt-cell system.
Introduction
Vikningen av även relativt enkla proteiner innebär många olika fällbara enzymer, molekylär chaperones och kovalenta modifieringar1. En komplett beredning av dessa processer i vitro är praktiskt taget omöjligt, med tanke på det stora antalet olika komponenter inblandade. Det är därför önskvärt, att studera protein vikning i vivo, i levande celler. Radioaktiva puls-chase tekniker bevisa ett kraftfullt verktyg för att studera den syntes, vikning, transport och nedbrytning av proteiner i deras naturliga miljö.
Den metabola märkning av proteiner under en kort puls med 35S-märkt metionin/cystein, följt av en jakt i avsaknad av en radioaktiv märkning, tillåter spårning av antalet nyligen syntetiserade proteiner i den breda cellulära miljön. Sedan målproteiner kan vara isolerade via immunoprecipitation och analyseras via SDS-PAGE eller andra tekniker. För många proteiner präglas deras resa genom cellen av ändringar som är synliga på SDS-PAGE gel. Exempelvis åtföljs transport av glykosylerat proteiner från endoplasmatiska retiklet (ER) till Golgi komplexet ofta av ändringar av N-länkade glycans eller tillägg av O-länkade glycans2,3. Dessa ändringar orsaka stora ökningar i det uppenbara molekylära samlas, som kan ses av rörlighet förändringar i SDS-PAGE. Mognaden kan också markeras genom proteolytisk klyvning, såsom signal-peptid klyvning eller avlägsnande av pro-peptider, vilket resulterar i förändringar i den uppenbara molekylära massa som enkelt kan följas på SDS-PAGE gel4. Radioaktiviteten har betydande fördelar jämfört med jämförbara tekniker såsom Kungliga Automobilklubben jakter, där romanen proteinsyntesen förhindras, som längre behandlingar är giftiga för celler och utesluter inte majoriteten av äldre, steady state proteiner från den analys, som vissa proteiner har halveringstider dagar. Jämförelse av proteiner under både nonreducing och minska villkor tillåter analys av disulfide bond bildandet, ett viktigt steg i vikningen av många sekretoriska proteiner4,5,6, 7.
Här beskrivs en allmän metod för analys av proteinveckning och transport i intakta celler, med hjälp av radioaktiva puls-chase tillvägagångssättet. Medan vi har syftar till att ge metoden som detaljerat som möjligt, protokollet har en nästan obegränsad potential för anpassningsförmåga och tillåter optimering att studera varje läsarens specifika proteiner.
Två alternativa puls-chase protokoll, en för vidhäftande celler (steg 1.1 av protokollet presenteras här) och en för suspension celler (steg 1.2 i protokollet presenteras här) tillhandahålls. Villkor som anges här är tillräckliga för att visualisera ett protein som uttrycks med medelhög – till hög-uttryck nivåer. Om läsaren arbetar med dåligt uttryckta proteiner eller olika posttreatment villkor, såsom flera immunoprecipitations, är det nödvändigt att öka storleken på skålen eller mobiltelefonnummer på lämpligt sätt.
För suspension puls chase tas chase proverna vid varje tidpunkt från en enda slang av celler. Tvätta stegen efter pulsen är utelämnade; i stället ytterligare förhindras inkorporering av 35S genom utspädning med en hög överskott av omärkta metionin och cystein.
De presenteras protokoll använder radioaktiva 35S-märkt cystein och metionin följa cellulära proteinveckning processer. All verksamhet med radioaktiv reagenserna bör utföras med lämpliga skyddsåtgärder för att minimera all exponering av operatören och miljön för radioaktiv strålning och utföras i ett laboratorium som utsetts. Som puls-chase märkning teknik är relativt ineffektiv kort puls tider (< 15 min), mindre än 1% av grundbelopp för radioaktivitet är införlivad i de nyligen syntetiserade proteinerna. Efter anrikningen av den mål protein via immunoprecipitation innehåller provet för SDS-PAGE mindre än 0,05% av grundbelopp för radioaktivitet.
Även om de 35S metionin och cystein märkning mix stabiliseras, kommer att vissa nedbrytning, framställning av flyktiga radioaktiva föreningar, uppstå. För att skydda forskaren och apparaten, bör vissa försiktighetsåtgärder vidtas. Forskaren bör alltid följa säkerhetsbestämmelser som lokal strålning och kan bära en kolteckning som omvårdnad mask, förutom en labbrock och (dubbel) handskar. Beståndet injektionsflaskor med 35S metionin och cystein bör alltid öppnas i dragskåp eller i en lokal aspiration punkt. Kända laboratorium kontaminering fläckar är centrifuger, pipetter, vattenbad, inkubatorer och shakers. Kontaminering av dessa områden minskas med pipettspetsar med ett kolfilter, positiv-seal mikrocentrifugrör (se Tabell för material), akvarium träkol svampar i vatten bad, träkol filtrerpapper limmade i puls-chase maträtter, träkol vakt i systemets aspiration och placeringen av rätter som innehåller träkol spannmål i inkubatorer och förvaringskärl.
Protocol
Representative Results
Discussion
Puls-chase metoder har varit avgörande för utvecklingen av forskarnas förståelse av protein vikning i intakta celler. Medan vi har försökt att ge en metod som är lika allmän som möjligt, har detta tillvägagångssätt potentialen för nästan obegränsade variationer att studera olika processer som inträffar under vikningen, transport, och livet av proteiner inuti cellen.
När du utför en puls chase med vidhäftande celler i rätter, är det viktigt att behandla varje maträtt som d…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar alla medlemmar för Braakman lab, förbi och närvarande för deras fruktbara diskussioner och hjälp i att utveckla de metoder som presenteras i denna artikel. Detta projekt har beviljats medel från både Europeiska forskningsrådet under EU: s sjunde ramprogram (FP7/2007-2013) N ° 235649 och Nederländerna organisation av vetenskaplig forskning (NWO) under den ECHO-programmet N ° 711.012.008.
Materials
| 1.5 mL safeseal microcentrifuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Acetic Acid | Sigma | A6283 | glacial acetic acid |
| BAS Storage phosphor screen 20×25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromophenol Blue | Sigma | B8026 | Molecular biology grade |
| Carestream Biomax MR films | Kodak | Z350370-50EA | |
| Cell-culture media | Various | N/A | Normal cell culture media for specific cell-lines used |
| Cell-culture media, no methionine/cysteine | Various | N/A | Same media formulation as normal culture media e.g DMEM/MEM/RPMI, lacking methionine and cysteine |
| Charcoal filter paper | Whatman | 1872047 | |
| Charcoal filtered pipette tips | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Charcoal vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | for electrophoresis |
| Cysteine | Sigma | C7352 | Molecular biology grade, Make 500 mM stock, store at -20 |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Molecular biology grade |
| EasyTag Express35S Protein Labeling Mix | Perkin Elmer | NEG772014MC | Other size batches of label are available depending on useage |
| EDTA | Sigma | E1644 | Molecular biology grade |
| Gel-drying equipment | Various | N/A | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Molecular biology grade |
| Grade 3 chromatography paper | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Molecular biology grade, Make 1M stock pH 7.4, store at 4˚C |
| Kimwipes delicate task wipes | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Molecular biology grade |
| Methanol | Sigma | MX0490 | |
| Methionine | Sigma | M5308 | Molecular biology grade, Make 250 mM stock, store at -20 |
| Minigel casting/running equipment | Various | N/A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Molecular biology grade |
| N-ethylmaleimide | Sigma | E3876 | Molecular biology grade, Make 1M stock in 100% ethanol, store at -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Molecular biology grade |
| Protein-A Sepharose fastflow beads | GE health-care | 17-5280-04 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | Molecular biology grade |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Molecular biology grade |
| Trizma base (Tris) | Sigma | T6066 | Molecular biology grade |
| Typhoon IP Biomolecular imager | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Test Tube Rack 20 mm for waterbath | Nalgene | 5970-0320PK |
Referências
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
- Lamriben, L., Graham, J. B., Adams, B. M., Hebert, D. N. N-Glycan-based ER Molecular Chaperone and Protein Quality Control System: The Calnexin Binding Cycle. Traffic. 17 (4), 308-326 (2016).
- Snapp, E. L., et al. Structure and topology around the cleavage site regulate post-translational cleavage of the HIV-1 gp160 signal peptide. Elife. 6, 26067 (2017).
- Braakman, I., Hoover-Litty, H., Wagner, K. R., Helenius, A. Folding of influenza hemagglutinin in the endoplasmic reticulum. Journal of Cell Biology. 114 (3), 401-411 (1991).
- Jansens, A., van Duijn, E., Braakman, I. Coordinated nonvectorial folding in a newly synthesized multidomain protein. Science. 298 (5602), 2401-2403 (2002).
- Land, A., Braakman, I. Folding of the human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein in the endoplasmic reticulum. Biochimie. 83 (8), 783-790 (2001).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. Retroviral Transduction of Helper T Cells as a Genetic Approach to Study Mechanisms Controlling their Differentiation and Function. Journal of Visualized Experiments. (117), e54698 (2016).
- Das, A. T., Land, A., Braakman, I., Klaver, B., Berkhout, B. HIV-1 evolves into a nonsyncytium-inducing virus upon prolonged culture in vitro. Virology. 263 (1), 55-69 (1999).
- Chen, W., Helenius, J., Braakman, I., Helenius, A. Cotranslational folding and calnexin binding during glycoprotein synthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (14), 6229-6233 (1995).
- Daniels, R., Kurowski, B., Johnson, A. E., Hebert, D. N. N-linked glycans direct the cotranslational folding pathway of influenza hemagglutinin. Molecular Cell. 11 (1), 79-90 (2003).
- Ferreira, L. R., Norris, K., Smith, T., Hebert, C., Sauk, J. J. Association of Hsp47, Grp78, and Grp94 with procollagen supports the successive or coupled action of molecular chaperones. Journal of Cellular Biochemistry. 56 (4), 518-526 (1994).
- Hoelen, H., et al. The primary folding defect and rescue of DeltaF508 CFTR emerge during translation of the mutant domain. PLoS One. 5 (11), 15458 (2010).
- Kleizen, B., van Vlijmen, T., de Jonge, H. R., Braakman, I. Folding of CFTR is predominantly cotranslational. Molecular Cell. 20 (2), 277-287 (2005).
- Hagiwara, M., Ling, J., Koenig, P. A., Ploegh, H. L. Posttranscriptional Regulation of Glycoprotein Quality Control in the Endoplasmic Reticulum Is Controlled by the E2 Ub-Conjugating Enzyme UBC6e. Molecular Cell. 63 (5), 753-767 (2016).
- Copeland, C. S., Doms, R. W., Bolzau, E. M., Webster, R. G., Helenius, A. Assembly of influenza hemagglutinin trimers and its role in intracellular transport. Journal of Cell Biology. 103 (4), 1179-1191 (1986).
