Aqui descrevemos um protocolo para um método de pulso-perseguição geral que permite a análise cinética de dobramento, transporte e degradação de proteínas a serem seguidos em células vivas.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pulso-perseguição radioativo rotulagem é uma poderosa ferramenta para estudar a maturação conformacional, o transporte para sua localização celular funcional e a degradação de proteínas do alvo em células vivas. Com curto (pulso) radioativos vezes (< 30 min) e rigidamente controlado tempos de perseguição, é possível rotular apenas uma pequena fração da piscina proteína total e siga sua dobradura. Quando combinado com os/redução electroforese do gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE) e imunoprecipitação com anticorpos (conformação específicos), processos de dobramento pode ser examinado em grande detalhe. Este sistema tem sido usado para analisar o dobramento de proteínas com uma enorme variação nas propriedades, tais como proteínas solúveis, proteínas transmembrana única e multi-pass, fortemente glicosilados N - e O proteínas e proteínas com e sem bissulfeto de extensivo criar laços. Pulso-perseguição métodos são a base de estudos cinéticos em uma gama de recursos adicionais, incluindo co - e modificações do posttranslational oligomerização e polimerização, essencialmente, permitindo a análise de uma proteína desde o nascimento até a morte. Estudos de pulso-perseguição no enrolamento de proteínas são complementares com outros métodos de bioquímicos e biofísicos para estudar proteínas em vitro , fornecendo informações fisiológicas e maior resolução temporal. Os métodos descritos dentro deste papel adaptam-se facilmente para estudar o dobramento de quase qualquer proteína que pode ser expressa em sistemas de mamíferos ou inseto-célula.
Introdução
A dobradura do mesmo relativamente simples proteínas envolve muitas enzimas diferentes de dobramento moleculares chaperones e modificações covalentes1. Uma reconstituição completa destes processos em vitro é praticamente impossível, dado o vasto número de diferentes componentes envolvidos. Portanto, é altamente desejável, para estudar a proteína dobra na vivo, em células vivas. Técnicas de pulso-perseguição radioativo provam uma poderosa ferramenta para estudar a síntese, dobradura, transporte e degradação de proteínas em seu ambiente natural.
A metabólica rotulagem de proteínas durante um curto pul....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os reagentes radioativos e procedimentos foram tratados em conformidade com os regulamentos e regras locais de radiação de Universidade de Utrecht.
1. pulso Chase
-
Perseguição de pulso para células aderentes
Nota: Os volumes dados aqui baseiam-se em pratos de cultura de células de 60 mm. Para 35mm ou pratos de 100 milímetros, multiplique os volumes por 1/2 ou 2, respectivamente. Este protocolo usa um tempo de pulso de 10 min e chase vezes de 0, 15, 30, 60, 120 e 240 min. Estas podem ser variadas dependendo as proteínas específicas estudadas (discutidas abaixo).- Semente células aderentes (por e....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
O dobramento e a secreção de HIV-1 gp120 de uma perseguição de pulso aderentes é mostrado na Figura 2. O gel os (NR de células na figura) mostra o dobramento oxidativo da gp120. Imediatamente após o pulso de rotulagem da gp120 5 min (0 min perseguição) aparece como uma banda difusa superior no gel, e no decorrer do assunto, a banda migra para baixo o gel através de ainda mais difundida dobradura intermediários (IT), até que se acumula na banda apertada (NT) I.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Pulso-perseguição métodos têm sido essenciais para o desenvolvimento da compreensão dos cientistas de proteína nas células intactas de dobramento. Enquanto tentamos fornecer um método que é tão geral quanto possível, esta abordagem tem o potencial para variações quase ilimitadas estudar vários processos que ocorrem durante o dobramento, o transporte e a vida das proteínas dentro da célula.
Ao realizar uma perseguição de pulso usando células aderentes em pratos, é essencial para tratar cada pra.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Os autores agradecer todos os membros do laboratório Braakman, passado e presente, para suas discussões frutuosos e ajudam a desenvolver os métodos apresentados neste artigo. Este projeto recebeu financiamento do Conselho Europeu de investigação no âmbito sétimo programa-quadro (FP7/2007-2013) N ° da União Europeia 235649 e Holanda organização de científico pesquisa (NWO) sob o eco-programa N ° 711.012.008.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de microcentrífuga safeseal de 1,5 mL | Sarstedt | 72.706.400 | |
| Ácido acético | Sigma | A6283 | glacial ácido acético |
| BAS Tela de fósforo de armazenamento 20x25 cm | GE Life Sciences | 28956475 | |
| Bromofenol Blue | Sigma | B8026 | Grau de biologia molecular |
| Carestream Biomax MR filmes | Kodak | Z350370-50EA | |
| Meios de cultura celular | Vários | N/A | Meios de cultura de células normais para linhagens celulares específicas utilizadas |
| Meios de cultura celular, sem metionina/cisteína | Vários | N/A | Mesma formulação de meios que os meios de cultura normais, por exemplo, DMEM/MEM/RPMI, sem metionina e cisteína |
| Papel de filtro de carvão | O que é | 1872047 | |
| Pontas de pipeta filtradas com carvão | Molecular bioproducts | 5069B | |
| Carvão vacu-guard | Whatman | 67221001 | |
| Coomassie Brilliant Blue R250 | Sigma | 112,553 | para eletroforese |
| Cisteína | Sigma | C7352 | Grau de biologia molecular, Faça estoque de 500 mM, armazene a -20 |
| Ditiotreitol (DTT) | Sigma | 10197777001 | Grau de biologia molecular |
| EasyTag Express35S Mistura de rotulagem de proteínas | Perkin Elmer | NEG772014MC | Outros lotes de tamanho de rótulo estão disponíveis dependendo do uso |
| EDTA | Sigma | E1644 | Grau de biologia molecular |
| Equipamento de secagem em gel | Vários | N / A | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | Papel |
| cromatografia | GE Life Sciences | 3003-917 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 24020117 | |
| Kimwipes lenços delicados | VWR | 21905-026 | |
| MES | Sigma | M3671 | Grau de biologia molecular |
| Metanol | Sigma | MX0490 | |
| Metionina | Sigma | M5308 | Grau de biologia molecular, Faça estoque de 250 mM, armazene em -20 |
| Minigel equipamento de fundição / funcionamento | Vários | N / A | |
| NaCl | Sigma | S7653 | Grau de biologia molecular |
| N-etilmaleimida | Sigma | E3876 | Grau de biologia molecular, Faça estoque de 1M em 100% etanol, armazene em -20 |
| PBS | Sigma | P5368 | Proteína de grau |
| Sepharose fastflow grânulos | GE cuidados de saúde 17-5280-04 | ||
| Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) | Sigma | L3771 | Grau de biologia molecular |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | Grau de biologia molecular |
| Base Trizma (Tris) | Sigma | T6066 | Grau de biologia molecular |
| Typhoon IP Gerador de imagens biomolecular | Amersham | 29187194 | |
| Unwire Rack de tubos de ensaio 20 mm para banho-maria | Nalgene | 5970-0320PK |
Referências
- Ellgaard, L., McCaul, N., Chatsisvili, A., Braakman, I. Co- and Post-Translational Protein Folding in the ER. Traffic. 17 (6), 615-638 (2016).
- Pisoni, G. B., Molinari, M. Five Questions (with their Answers) on ER-Associated Degradation. Traffic. 17 (4), 341-350 (2016).
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
