Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação
Summary
Mutações no rico gene de leucina repetição quinase 2 (LRRK2) causam doença hereditária de Parkinson. Desenvolvemos um método fácil e robusto para avaliar a fosforilação controlada por LRRK2 de Rab10 em neutrófilos de sangue periféricos humanos. Isso pode ajudar a identificar indivíduos com aumento da atividade da via de quinase LRRK2.
Abstract
A rica incidência de quinase 2 (LRRK2) é o gene mais frequentemente mutado na doença hereditária de Parkinson (DP) e todas as mutações lRRK2 patogênicas resultam na hiperativação de sua função quinase. Aqui, descrevemos um ensaio fácil e robusto para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em neutrófilos de sangue periférico sénior humano medindo a fosforilação controlada por LRRK2 de um de seus substratos fisiológicos, Rab10 at threonine 73. A análise imunoblotting descrita requer um anticorpo totalmente seletivo e fosforespecífico que reconhece o rab10 Thr73 fosforilado por LRRK2, como o anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10. Ele usa neutrófilos de sangue periféricos humanos, porque o sangue periférico é facilmente acessível e os neutrófilos são um constituinte abundante e homogêneo. É importante ressaltar que os neutrófilos expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab10. Uma desvantagem potencial dos neutrófilos é sua alta atividade protease serinica intrínseca, que requer o uso de inibidores de protease muito potentes, como o organophosphorus neurotoxin diisopropilfluorofosfato (DIFP) como parte do tampão de lise. No entanto, os neutrófilos são um recurso valioso para a pesquisa sobre a atividade da via de quinase LRRK2 in vivo e devem ser considerados para inclusão em coleções biorepositórias de DP.
Introduction
As tentativas de retardar ou parar a doença de Parkinson (DP) falharam até agora. A descoberta de mutações hiperativanas na rica incidência repetição quinase 2 (LRRK2) que causam e/ou aumentam o risco de DP levou ao desenvolvimento de inibidores de quinase LRRK21,2,3. Estes já entraram em ensaios clínicos4. A função exata do LRRK2 não é clara, mas um grande avanço tem sido a identificação de um subconjunto de proteínas Rab GTPase, incluindo Rab10, como os primeiros substratos fisiológicos de boa fé da quinase LRRK25,6,7. Os principais desafios na era da terapêutica modificadora de doenças são marcadores bioquímicos do status de ativação da quinase LRRK2 e o engajamento alvo dos inibidores da quinase LRRK2.
Até agora, o principal marcador farmacocinético para inibidores LRRK2 in vivo tem sido um aglomerado de resíduos serinas constitutivamente fosforilados de LRRK2, em particular serino 935, que se tornam defosforilados em resposta aos diversos inibidores lRRK28,9. No entanto, a fosforilação serina 935 não se correlaciona com a atividade intrínseca celular LRRK2 quinase porque não é diretamente fosforilada por LRRK2 e ainda é fosforilada em quinase-inativa LRRK210. A atividade de quinase LRRK2 correlaciona-se bem com a autofosforilação de serina 1292, mas não é em termos práticos uma leitura adequada para a atividade endógena lRRK2 quinase por análise imunoblot de extratos celulares inteiros devido à atual falta de anticorpos confiáveis e fosfoespecíficos para este site10,11.
Desenvolvemos um ensaio robusto e fácil para quantificar a atividade da via de quinase LRRK2 em células sanguíneas periféricas humanas que mede a fosforilação controlada por LRRK2 de sua proteína alvo fisiológica Rab10 em threonine 7311. O sangue periférico é facilmente acessível por venesection, que é um procedimento de baixo risco e rápido que causa desconforto mínimo. Focamos em neutrófilos de sangue periféricos humanos porque eles constituem uma população abundante (37-80% de todos os glóbulos brancos) e células homogêneas que expressam níveis relativamente altos tanto de LRRK2 quanto de Rab1011. Além disso, os neutrófilos sanguíneos periféricos podem ser isolados de forma rápida e eficiente, empregando uma abordagem negativa imunomagnética. Para garantir que a fosforilação rab10 subseqüente observada seja mediada por LRRK2, cada lote de neutrófilos é incubado com ou sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK2 (usamos e recomendamos MLi-2)2,12. Isso é seguido por lise celular em um tampão contendo o inibidor de protease fluorofosfato de diisopropílico (DIFP), que é necessário para suprimir a atividade de protease serina intrínseca que é conhecida por ser alta em neutrófilos13. Para a análise final por imunoblotação quantitativa, recomendamos o uso do anticorpo monoclonal de coelho MJFF-pRab10 que detecta especificamente o Rab10 Thr73-phosphoepitope e não reage cruzadamente com outras proteínas rab fosforiladas14. A seletividade e especificidade deste anticorpo foi validada em modelos de superexpressão de diferentes proteínas Rab e uma linha de células knock-out A549 Rab1014. Assim, medimos a diferença na fosforilação rab10 em lisatos neutrófilos que foram tratados com e sem um potente e seletivo inibidor de quinase LRRK22. Alternativamente, as amostras também poderiam ser analisadas por outros métodos, como espectrometria de massa quantitativa.
Em conclusão, a fosforilação rab10 controlada por LRRK2 é um marcador superior da atividade de quinase LRRK2 à fosforilação LRRK2 na serina 935 e os neutrófilos de sangue periféricos humanos são um recurso valioso para a pesquisa de PD em LRRK2. Nosso protocolo fornece um ensaio robusto e fácil para interrogar a atividade da via LRRK2 em neutrófilos sanguíneos periféricos e permite a estratificação bioquímica de indivíduos com aumento da atividade de quinase LRRK215. É importante ressaltar que esses indivíduos podem se beneficiar de futuros tratamentos inibidores de quinase LRRK2.
Protocol
Representative Results
Discussion
Evidências clínicas, genéticas e bioquímicas convincentes apontam para um papel importante para o LRRK2 e, em particular, sua função quinase na doença de Parkinson7. Os inibidores da quinase LRRK2 foram desenvolvidos e estão entrando em ensaios clínicos2,4,12. Como tal, há a necessidade de explorar o LRRK2 como um biomarcador para o engajamento do alvo, bem como a estratificação do paciente. N…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos voluntários saudáveis que gentilmente doaram sangue para o presente estudo. Agradecemos à Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (MJFF) e à liderança do estudo Fox BioNet (FBN) pelo apoio e contribuição ao protocolo escrito e ao vídeo. Agradecemos ao professor Alexander Zimprich, da Universidade de Viena, na Áustria, por testar nosso protocolo e colaboração. Valorizamos as contribuições de Paulo Davies para o projeto (gerente geral da PPU MRC). Também reconhecemos o excelente suporte técnico das equipes de purificação de anticorpos e de Fosforilação de Proteína mrc (PPU), ou seja, Síntese Química (Natalia Shpiro para sintetização MLi-2), Reagentes de Reagentes e Serviços de Purificação de Mrc PPU (coordenados por equipes de purificação de anticorpos (coordenadas por equipes de purificação de anticorpos do MRC PPU e Services (coordenadas por equipes de purificação de anticorpos (coordenadas por Hilary McLauchlan e James Hastie). Agradecemos a Mhairi Towler e Fraser Murdoch da Vivomotion por sua ajuda na produção dos vídeos e animações. Agradecemos a Steve Soave, de 81 filmes, pela ajuda com as edições finais. Esther Sammler é apoiada por uma Bolsa Acadêmica Clínica Clínica Sênior Escocesa e recebeu financiamento do Reino Unido de Parkinson (K-1706).
Materials
| 1 mL Pipette tips | Sarstedt | 70.762 | or equivalent |
| 1.5 mL Micro tubes | Sarstedt | 72.690.001 | or equivalent |
| 10 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1254.025 | or equivalent |
| 10 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.113 | or equivalent |
| 15 mL falcon tube | Cellstar | 188 271 | or equivalent |
| 200 μL Pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | or equivalent |
| 25 mL Pipette tips | Sarstedt | 86.1685.001 | or equivalent |
| 50 mL falcon tube | Cellstar | 227 261 | or equivalent |
| BD Vacutainer Hemogard Closure Plastic K2-EDTA Tube | BD | BD 367525 | or equivalent |
| Beckman Coulter Allegra X-15R centrifuge | Beckman | or equivalent centrifuge with swimging bucket rotator for 15 mL and 50 mL falcon tubes at speed 1000-1200 x g | |
| Category 2 biological safety cabinet. | |||
| cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail | Roche | 11836170001 | |
| DIFP (Diisopropylfluorophosphate) | Sigma | D0879 | Prepare 0.5M stock solution in isopropanol using special precautions |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | 6250 | |
| Dry ice or liquid nitrogene | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline | ThermoFisher | 14190094 | or equivalent |
| Easy 50 EasySep Magnet | Stemcell | 18002 | for holding 1 x 50ml conical tube |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | Stemcell | 19666 | This contains Solutions called “Isolation Cocktail” and “RapidSpheres magnetic beads |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Eppendorf centrifuge 5417R centrifuge | Eppendorf | ||
| Ethanol, in spray bottle | |||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Ice | |||
| Isopropanol (anhydrous grade) | Sigma | 278475 | |
| Lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1%(v/v) Triton X-100, 1 mM EGTA, 1 mM Na3VO4, 50 mM NaF, 10 mM β-glycerophosphate, 5 mM sodium pyrophosphate, 0.27 M sucrose, 0.1% (v/v) β-mercaptoethanol, 1x cOmplete(EDTA-free) protease inhibitor cocktail (Roche), 1 μg/ml Microcystin-LR, 0.5 mM diisopropylfluorophosphate (DIFP). | alternatively frozen lysis buffer in aliquots without Microcystin-LR, DIFP available from MRC-PPU Reagents (http://mrcppureagents.dundee.ac.uk/) | ||
| Merck LRRK2 inhibitor II (MLi-2) | Merck | 438194-10MG | or equivalent (potent and selective LRRK2 inhinitor) |
| Microcystin-LR | Enzo Life Sciences | ALX-350-012-M001 | 1 mg/ml stock in DMSO and store at -80 oC. |
| Na3VO4 | Aldrich | 450243 | |
| NaF | Sigma | S7920 | |
| Odyssey CLx scan Western Blot imaging system | Odyssey | ||
| Permanent marker pen | |||
| Personal protection equipment | |||
| RPMI 1640 Medium | ThermoFisher | 21875034 | or equivalent |
| sodium pyrophosphate | Sigma | S22 | |
| sucrose | Sigma | S0389 | |
| β-glycerophosphate | Sigma | 50020 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Suggested antibodies for Western blotting | |||
| Anti-RAB10 (phospho T73) antibody [MJF-R21] | abcam | ab230261 | |
| Anti-α-tubulin | Cell Signaling Technologies | 5174 | used at 1:2000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 680LT | LI-COR | 926-68020 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-mouse IRDye 800CW | LI-COR | 926-32210 | used at 1:10,000 dilution |
| Goat anti-rabbit IRDye 800CW | LI-COR | 926-32211 | used at 1:10,000 dilution |
| MJFF-total Rab10 mouse antibody | generated by nanoTools (nanotools.de) | not applicable* | used at 2 μg/ml final concentration; * The MJFF-total Rab10 antibody generated by nanoTools (www.nanotools.de) [11] will be commercialised by the Michael J Fox Foundation in 2018 |
| Mouse anti-LRRK2 C-terminus antibody | Antibodies Incorporated | 75-253 | used at 1 μg/ml final concentration |
| pS935-LRRK2 | MRC PPU Reagents and Services | UDD2 | MJFF-total Rab10 mouse antibody |
Referências
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