Использование Microarrays для допроса микроenvironmentale влияние на клеточные фенотипы при раке
Summary
Цель метода, представленного здесь, состоит в том, чтобы показать, как микроокружение microarrays (MEMA) могут быть изготовлены и использованы для допроса воздействия тысяч простых комбинаторных микросред на фенотип культивированных клеток.
Abstract
Понимание влияния микроокружения на фенотип клеток является сложной проблемой из-за сложной смеси как растворимых факторов роста, так и матричных белков в микроокружении in vivo. Кроме того, легкодоступные реагенты для моделирования микросред в пробирке обычно используют сложные смеси белков, которые не полностью определены и страдают от пакетной к пакетной изменчивости. Платформа микроокружения microarray (MEMA) позволяет оценить тысячи простых комбинаций белков микросреды для их воздействия на клеточные фенотипы в одном анализе. MEMAs готовятся в колодцах, что позволяет добавление отдельных лигандов отделять скважины, содержащие массивные внеклеточные матричные белки (ECM). Сочетание растворимого лиганда с каждым печатным ECM образует уникальное сочетание. Типичный анализ MEMA содержит более 2500 уникальных комбинаторных микросред, что клетки подвергаются в одном анализе. В качестве тестового случая, линия клеток рака молочной железы MCF7 была покрыта на платформе MEMA. Анализ этого анализа выявил факторы, которые как усиливают и препятствуют росту и распространению этих клеток. Платформа MEMA является очень гибкой и может быть расширена для использования с другими биологическими вопросами, помимо исследований рака.
Introduction
Культирование раковых клеток линий на пластике в двумерных (2D) монослой остается одним из основных рабочих лошадок для исследователей рака. Тем не менее, микросреда все больше признается за его способность влиять на клеточные фенотипы. При раке, микроокружение опухоли, как известно, влияет на несколько клеточного поведения, в том числе рост, выживание, вторжение, и ответ на терапию1,2. Традиционные монослойные клеточные культуры, как правило, не имеют влияния микроэкологии, что привело к разработке более сложных трехмерных (3D) анализов для выращивания клеток, в ключая коммерчески доступные очищенные экстракты мембраны подвала. Тем не менее, эти очищенные матрицы, как правило, сложны в использовании и страдают от технических проблем, таких как вариабельность пакетов3 и сложные композиции3. В результате, это может быть трудно назначить функцию конкретных белков, которые могут влиять на клеточные фенотипы3.
Для устранения этих ограничений мы разработали технологию микроокружения microarray (MEMA), которая сводит микроокружение к простым сочетаниям внеклеточной матрицы (ECM) и растворимых белков фактора роста4,5 . Платформа MEMA позволяет выявлять доминирующие микроэкологические факторы, влияющие на поведение клеток. Используя формат массива, тысячи комбинаций факторов микросреды могут быть рассмотрены в одном эксперименте. MEMA описал здесь допрашивает 2500 различных уникальных условий микросреды. Белки ECM, напечатанные в хорошо пластины образуют рост колодки, на которых клетки могут быть культивированы. Растворимые лиганды добавляются в отдельные скважины, создавая уникальные комбинаторные микросреды (ECM и ligand) на каждом различном месте, к которому подвергаются клетки. Клетки культивируются в течение нескольких дней, затем фиксируются, окрашиваются и образуются для оценки клеточных фенотипов в результате воздействия этих специфических комбинаций микросреды. Поскольку микросреда представляет собой простые комбинации, легко определить белки, которые управляют основными фенотипическими изменениями в клетках. MEMAs были успешно использованы для выявления факторов, которые влияют на несколько клеточных фенотипов, в том числе те, которые управляют решениями судьбы клеток и ответ на терапию4,5,6,7. Эти ответы могут быть проверены в простых 2D-экспериментов, а затем могут быть оценены в условиях, которые более полно резюмировать сложность микросреды опухоли. Платформа MEMA хорошо адаптируется к различным типам клеток и конечным точкам, при условии, что имеются хорошие фенотипические биомаркеры.
Protocol
Representative Results
Discussion
Важность “мерности” и контекста был мотивирующее фактор в развитии систем культуры in vitro в качестве инструментов в характеристике раковых клеток через их взаимодействие с микросредой11, и способность in vitro культурные системы для имитации среды in vivo является движущей силой с…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана NIH Общий фонд Библиотека сетевых сотовых подписей (LINCS) грант HG008100 (J.W.G., L.M.H., и J.E.K.).
Materials
| Aushon 2470 | Aushon BioSystems | Arrayer robot system used in the protocol | |
| Nikon HCA | Nikon | High Content Imaging system designed around Nikon Eclipse Ti Inverted Microscope | |
| BioTek Precision XS liquid Handler | BioTek | liquid handling robot used in the protocol | |
| Trizma hydrochloride buffer solution | Sigma | T2069 | |
| EDTA | Invitrogen | 15575-038 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Tween 20 | Sigma | P7949 | |
| Kolliphor P338 | BASF | 50424591 | |
| 384-well microarray plate, cylindrical well | Thermo Fisher | ab1055 | |
| Nunc 8 well dish | Thermo Fisher | 267062 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BSA | Fisher | BP-1600 | |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Cell Mask | Molecular Probes | H32713 | |
| Click-iTEdU Alexa Fluor | Molecular Probes | C10357 | |
| DAPI | Promo Kine | PK-CA70740043 | |
| ALCAM | R & D Systems | 656-AL | ECM |
| Cadherin-20 (CDH20) | R & D Systems | 5604-CA | ECM |
| Cadherin-6 (CDH6) | R & D Systems | 2715-CA | ECM |
| Cadherin-8 (CDH8) | R & D Systems | 188-C8 | ECM |
| CD44 | R & D Systems | 3660-CD | ECM |
| CEACAM6 | R & D Systems | 3934-CM | ECM |
| Collagen I | Cultrex | 3442-050-01 | ECM |
| Collagen Type II | Millipore | CC052 | ECM |
| Collagen Type III | Millipore | CC054 | ECM |
| Collagen Type IV | Sigma | C5533 | ECM |
| Collagen Type V | Millipore | CC077 | ECM |
| COL23A1 | R & D Systems | 4165-CL | ECM |
| Desmoglein 2 | R & D Systems | 947-DM | ECM |
| E-cadherin (CDH1) | R & D Systems | 648-EC | ECM |
| ECM1 | R & D Systems | 3937-EC | ECM |
| Fibronectin | R & D Systems | 1918-FN | ECM |
| GAP43 | Abcam | ab114188 | ECM |
| HyA-500K | R & D Systems | GLR002 | ECM |
| HyA-50K | R & D Systems | GLR001 | ECM |
| ICAM-1 | R & D Systems | 720-IC | ECM |
| Laminin | Sigma | L6274 | ECM |
| Laminin-5 | Abcam | ab42326 | ECM |
| Lumican | R & D Systems | 2846-LU | ECM |
| M-Cad (CDH15) | R & D Systems | 4096-MC | ECM |
| Nidogen-1 | R & D Systems | 2570-ND | ECM |
| Osteoadherin/OSAD | R & D Systems | 2884-AD | ECM |
| Osteopontin (SPP) | R & D Systems | 1433-OP | ECM |
| P-Cadherin (CDH3) | R & D Systems | 861-PC | ECM |
| PECAM1 | R & D Systems | ADP6 | ECM |
| Tenascin C | R & D Systems | 3358-TC | ECM |
| VCAM1 | R & D Systems | ADP5 | ECM |
| vitronectin | R & D Systems | 2308-VN | ECM |
| Biglycan | R & D Systems | 2667-CM | ECM |
| Decorin | R & D Systems | 143-DE | ECM |
| Periostin | R & D Systems | 3548-F2 | ECM |
| SPARC/osteonectin | R & D Systems | 941-SP | ECM |
| Thrombospondin-1/2 | R & D Systems | 3074-TH | ECM |
| Brevican | R & D Systems | 4009-BC | ECM |
| Elastin | BioMatrix | 5052 | ECM |
| Fibrillin | Lynn Sakai Lab OHSU | N/A | ECM |
| ANGPT2 | RnD_Systems_Own | 623-AN-025 | Ligand |
| IL1B | RnD_Systems_Own | 201-LB-005 | Ligand |
| CXCL8 | RnD_Systems_Own | 208-IL-010 | Ligand |
| IGF1 | RnD_Systems_Own | 291-G1-200 | Ligand |
| TNFRSF11B | RnD_Systems_Own | 185-OS | Ligand |
| BMP6 | RnD_Systems_Own | 507-BP-020 | Ligand |
| FLT3LG | RnD_Systems_Own | 308-FK-005 | Ligand |
| CXCL1 | RnD_Systems_Own | 275-GR-010 | Ligand |
| DLL4 | RnD_Systems_Own | 1506-D4-050 | Ligand |
| HGF | RnD_Systems_Own | 294-HGN-005 | Ligand |
| Wnt5a | RnD_Systems_Own | 645-WN-010 | Ligand |
| CTGF | Life_Technologies_Own | PHG0286 | Ligand |
| LEP | RnD_Systems_Own | 398-LP-01M | Ligand |
| FGF2 | Sigma_Aldrich_Own | SRP4037-50UG | Ligand |
| FGF6 | RnD_Systems_Own | 238-F6 | Ligand |
| IL7 | RnD_Systems_Own | 207-IL-005 | Ligand |
| TGFB1 | RnD_Systems_Own | 246-LP-025 | Ligand |
| PDGFB | RnD_Systems_Own | 220-BB-010 | Ligand |
| WNT10A | Genemed_Own | 90009 | Ligand |
| PTN | RnD_Systems_Own | 252-PL-050 | Ligand |
| BMP3 | RnD_Systems_Own | 113-BP-100 | Ligand |
| BMP4 | RnD_Systems_Own | 314-BP-010 | Ligand |
| TNFSF11 | RnD_Systems_Own | 390-TN-010 | Ligand |
| CSF2 | RnD_Systems_Own | 215-GM-010 | Ligand |
| BMP5 | RnD_Systems_Own | 615-BMC-020 | Ligand |
| DLL1 | RnD_Systems_Own | 1818-DL-050 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 296-HR-050 | Ligand |
| KNG1 | RnD_Systems_Own | 1569-PI-010 | Ligand |
| GPNMB | RnD_Systems_Own | 2550-AC-050 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 350-NS-010 | Ligand |
| IL15 | RnD_Systems_Own | 247-ILB-005 | Ligand |
| TNF | RnD_Systems_Own | 210-TA-020 | Ligand |
| IGFBP3 | RnD_Systems_Own | 675-B3-025 | Ligand |
| WNT3A | RnD_Systems_Own | 5036-WNP-010 | Ligand |
| PDGFAB | RnD_Systems_Own | 222-AB | Ligand |
| AREG | RnD_Systems_Own | 262-AR-100 | Ligand |
| JAG1 | RnD_Systems_Own | 1277-JG-050 | Ligand |
| BMP7 | RnD_Systems_Own | 354-BP-010 | Ligand |
| TGFB2 | RnD_Systems_Own | 302-B2-010 | Ligand |
| VEGFA | RnD_Systems_Own | 293-VE-010 | Ligand |
| IL6 | RnD_Systems_Own | 206-IL-010 | Ligand |
| CXCL12 | RnD_Systems_Own | 351-FS-010 | Ligand |
| NRG1 | RnD_Systems_Own | 378-SM | Ligand |
| IGFBP2 | RnD_Systems_Own | 674-B2-025 | Ligand |
| SHH | RnD_Systems_Own | 1314-SH-025 | Ligand |
| FASLG | RnD_Systems_Own | 126-FL-010 | Ligand |
Referências
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- LaBarge, M. A., et al. Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments. Integrative Biology (Cambridge). 1 (1), 70-79 (2009).
- Watson, S. S., et al. Microenvironment-Mediated Mechanisms of Resistance to HER2 Inhibitors Differ between HER2+ Breast Cancer Subtypes. Cell Systems. 6 (3), 329-342 (2018).
- Ranga, A., et al. 3D niche microarrays for systems-level analyses of cell fate. Nature Communications. 5, 4324 (2014).
- Malta, D. F. B., et al. Extracellular matrix microarrays to study inductive signaling for endoderm specification. Acta Biomater. 34, 30-40 (2016).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Gagnon-Bartsch, J. A., Jacob, L., Speed, T. P. Removing Unwanted Variation from High Dimensional Data with Negative Controls. University of California, Berkeley, Department of Statistics, University of California, Berkeley. , (2013).
- Allan, C., et al. OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology. Nature Methods. 9 (3), 245-253 (2012).
- Simian, M., Bissell, M. J. Organoids: A historical perspective of thinking in three dimensions. Journal of Cell Biology. 216 (1), 31-40 (2017).
- Bissell, M. J. The differentiated state of normal and malignant cells or how to define a “normal” cell in culture. International Review of Cytology. 70, 27-100 (1981).
- Serban, M. A., Prestwich, G. D. Modular extracellular matrices: solutions for the puzzle. Methods. 45 (1), 93-98 (2008).
- Kaylan, K. B., et al. Mapping lung tumor cell drug responses as a function of matrix context and genotype using cell microarrays. Integrative Biology (Cambridge). 8 (12), 1221-1231 (2016).
- Lin, C. H., Jokela, T., Gray, J., LaBarge, M. A. Combinatorial Microenvironments Impose a Continuum of Cellular Responses to a Single Pathway-Targeted Anti-cancer Compound. Cell Reports. 21 (2), 533-545 (2017).
- Gjorevski, N., et al. Designer matrices for intestinal stem cell and organoid culture. Nature. 539 (7630), 560-564 (2016).
