Här beskriver vi en effektiv och reproducerbara strategi för att producera, titer och kvalitetskontroll partier av adeno-associerade virusvektorer. Det tillåter användaren att få en vektor beredning med hög-titer (≥ 1 x 1013 vektor genomen/mL) och en hög renhet, redo för bruk in vitro- eller in-vivo .
Gen leveransverktyg baserat på adeno-associerade virus (AAVs) är ett populärt val för leverans av transgener till det centrala nervsystemet (CNS), inklusive gen terapi program. AAV vektorer är icke-replikering, kan infektera både dela och icke-dela celler och ge långsiktiga transgenens uttryck. Ännu viktigare, vissa serotyper, såsom nyligen beskriven PHP. B, kan korsa blod-hjärna-barriären (BBB) i djurmodeller, efter systemisk leverans. AAV vektorer kan produceras effektivt i laboratoriet. Robust och reproducerbara protokoll krävs dock att erhålla AAV vektorer med tillräcklig renhet nivåer och antikroppnivåns värden tillräckligt hög för i vivo applikationer. Det här protokollet beskriver en effektiv och reproducerbara strategi för AAV vektor produktion, baserat på en iodixanol gradient rening strategi. Iodixanol rening metoden är lämplig för att erhålla partier av hög-titer AAV vektorer av hög renhet, jämfört med andra reningsmetoder. Protokollet är dessutom allmänt snabbare än andra metoder som för närvarande beskrivs. Dessutom en kvantitativ polymerasen kedjar reaktion (qPCR)-baserad strategi beskrivs för en snabb och noggrann bestämning av vektor titern, liksom silver färgning metod att bestämma renheten av vektor batchen. Slutligen, representativa resultat gen leverans till CNS, efter systemisk administrering av AAV-PHP. B, presenteras. Sådana resultat bör vara möjligt i alla laboratorier med de protokoll som beskrivs i denna artikel.
Under de senaste 30 åren, har vildtyp AAVs konstruerats för att skapa rekombinant AAV vektorer, som har visat sig vara mycket användbara verktyg för genöverföring till CNS1,2,3,4, 5,6 och gene therapy närmar sig till sjukdom (inklusive FDA – och EMA-godkänd terapier)4,7. Lämpligheten för användning i CNS härrör till stor del från deras förmåga att infektera icke-dividera, efter mitotiska celler, normalt återfinns i CNS8. AAV-baserade vektorer har emellertid också fördelen att ett långvarigt uttryck av någon viss terapeutisk transgenens4,9 medan framkalla en mildare immunsvar jämfört med andra virala vektorer7, 8,10,11,12.
De viktigaste delarna i varje AAV vektor är genomet och kapsid. Vildtyp AAVs är enkelsträngat (ss) DNA virus med en arvsmassa cirka 5 kilobases (kb)13. För produktion av rekombinant AAV vektorer, rep och cap generna (nödvändigt för genomet replikering och montering av viral kapsid) är bort från genomet hos den vildtyp AAV och tillhandahålls i trans, vilket lämnar utrymme för en uttryck kassett som innehåller transgenens14,15. Den inverterade terminal upprepa sekvenser (ITRs) av det ursprungliga virala genomet är de enda balanserade element i en AAV vektor, eftersom dessa är viktiga för replikering och förpackning3,10,14. AAV vektorer kan vara konstruerad för att förbättra transgenens uttryck; en mutation i en av ITRs leder till bildandet av en hårnål-loop som effektivt gör att genereringen av en kompletterande DNA strand3,7,15. Den största fördelen med denna konfiguration kallas en self-kompletterande (sc) genomet, är att det kringgår behovet av andra-strand syntes typiska i konventionella livscykeln för AAVs, avsevärt öka hastighet och nivåer av transgenens uttryck 1. dock använda en scAAV arvsmassa minskar lastkapacitet av vektorn för cirka 2,4 kb. Detta inkluderar transgenens sekvenser, liksom eventuella reglerande sekvenser såsom initiativtagare eller mikroRNA-bindande platser, för att begränsa uttrycket till viss cell typer16.
AAV kapsid avgör vektor-host cell interaktionen och ger en viss cell typ eller vävnad tropism för en AAV serotyp, som också kan utnyttjas för att begränsa transgenens uttryck till specifika platser. Flera AAV serotyper förekommer i naturen, medan andra har producerats i laboratorier genom rekombinant strategier (dvs, PHP. (B). Dessutom några förhoppningsvis också skänka andra användbara egenskaper, såsom möjlighet att korsa BBB, vilket resulterar i leveransen av transgener i hela CNS efter systemisk administrering. Detta har visats för AAV9 samt för den nyligen beskriven PHP. B kapsid17. Följaktligen bör har dessa serotyper visat sig vara särskilt relevanta för nya gen terapi metoder för neurodegenerativa sjukdomar1,17,18.
Syftet med detta protokoll är att beskriva en kostnadseffektiv metod för småskalig produktion av AAV vektorer med hög titer och renhet. Även om de resultat som presenteras här använder PHP. B kapsid och en scAAV uttryck kassett, protokollet är lämplig för produktion av flera AAV vektor serotyper och genomet konfigurationer, vilket ger maximal experimentella flexibilitet. Den vektor avkastning och slutliga renhet kan emellertid variera beroende på den valda serotypen.
Själva protokollet är en variant av den klassiska tri-transfection metoden för virala vektorn produktion och omfattar användning av en iodixanol lutning för vektor ren-upp, som i jämförelse med klassiskt användningen av cesium klorid (CsCl) lutningar, varit rapporterade för att producera AAV vektorer på ett mer tidseffektivt sätt19,20,21högre renhet.
Transfection, rening och koncentration stegen är avsedda att utföras enligt god laboratoriesed (GLP) i en vävnadskultur laboratorium varmt för virala vektorn arbete. Varje uppgift måste utföras i enlighet med den relevanta lokala och nationella lagstiftningen avseende viral vektor produktion och använda. Arbete måste utföras under en LAF och sterila förhållanden. Inuti anläggningen i vektor rekommenderas det att bära en lab-förkläde, utöver den regelbundna vävnadsodling labbrock. Dessutom bör en dubbel par handskar samt plast galoscher, bäras hela tiden.
Innan produktionsstart vektor, se till att all nödvändig utrustning och plasmider är tillgängliga. (1) pCapsid plasmiden innehåller den rep -genen som kodar fyra icke-strukturella proteiner nödvändiga för replikering, nämligen Rep78, Rep68, Rep52 och Rep40, och den gemensamma jordbrukspolitik -genen som kodar tre strukturella kapsid proteiner, nämligen VP1, VP2 och VP3. (2) pHelper plasmiden innehåller generna E4, E2Aoch VA från adenovirus, vilket underlättar AAV produktionen i HEK293T celler. (3) pTransgene plasmiden innehåller transgenens uttryck kassett, flankerad av två ITRs. Dessa plasmider kan vara syntetiskt de novo i laboratoriet använder sekvenser tillgängliga online22. För plasmider gjort de novo, är särskilt de som innehåller roman transgener, sekvensering skyldig att se till att transgenens och ITRs är rätt. Alternativt, premade plasmider kan förvärvas direkt genom online plasmid förråd. Vid behov, plasmider kan amplifieras och renas med hjälp av standard kit, enligt tillverkarens instruktioner23.
Vector titer och renhet kan påverka transduktion förmåga vektorn. Tilläggsprotokollen levereras för att utvärdera kvaliteten på de producerade vektorn. De slutliga vektorerna kommer att vara användbart för studier av funktionen CNS cell i både in vitro- och in-vivo applikationer.
Produktionen av rekombinant AAV vektorer beskrivs här använder material och utrustning som är gemensamma för de flesta molekylär biologi labs och cell kultur faciliteter. Det tillåter användaren att få ren, preklinisk grade AAV vektorer som kan användas för att rikta flera celler och vävnad typer inom en rad olika in vitro- och in-vivo -program. En av de största fördelarna med detta protokoll, jämfört med andra (dvs CsCl-baserade rening), är den korta arbetstiden som behövs. Ready-to-use AAV vektorer kan erhållas i högst 6 arbetsdagar efter den inledande transfection av HEK293T celler.
Flera faktorer kan negativt påverka den slutliga avkastningen eller kvaliteten på AAV vektorn. Stackars transfection effektivitet är en av de främsta orsakerna till en låg viral avkastning33. En stor rekommendation är att använda HEK293T celler som inte har varit anpassade mer än 20 gånger och har inte en cell sammanflödet större än 90% vid tidpunkten för transfection21. Transfection vald metod har dessutom stor inverkan på resultaten. Detta protokoll baseras på användning av PEI. PEI är en katjoniska polymer med förmåga att leverera exogent DNA till cellkärnan genom generering av komplex av polymer och nukleinsyra, känd som polyplexes, som tas upp av cellen och trafikerade via endosomes34. PEI-baserade transfection är lätt och snabbt att utföra, i motsats till andra allmänt använda metoder, såsom samfällning av DNA med kalciumfosfat35. PEI-baserade transfection är också mycket billigare jämfört med andra nyligen införda metoder, såsom användning av katjoniska lipider och magnet-medierad transfection36.
Rening strategin spelar en nyckelroll i protokollet. Jämfört med andra metoder, tenderar iodixanol-baserade reningar att innehålla en högre andel av Tom viruspartiklar (20%)20. Detta kompenseras, till en grad, av det faktum att iodixanol-baserade rening rutinmässigt resulterar i AAV vektor preparat med partikel-till-smittsamhet förhållande av mindre än 100. Detta innebär en betydande förbättring i jämförelse med konventionella CsCl-baserade förfaranden, som är betydande förlust av partikel smittsamhet rapporterade37. Ett annat vanligt alternativ metod att rena AAV vektorer är kromatografi-baserade rening. Men denna metod har den stora nackdelen att det krävs en särskild kolumn för varje vektor kapsid används: till exempel AAV2 är klassiskt isolerade med heparin kolumner, denna metod fungerar inte med AAV4 och AAV5, som inte äger heparin-bindande platser på deras förhoppningsvis38. Med tanke på att kromatografi rening är också dyra, är iodixanol-baserade rening generellt mer lämplig för laboratorier som vill producera hög kvalitet partier av AAV vektorer på en liten skala33,39, 40. men för att maximera den slutliga avkastning och renhet av vektor, extrem försiktighet behövs när du gör iodixanol Övertoningarna. De olika iodixanol fraktionerna ska överföras till ultracentrifugering röret med hjälp av en steril Pasteur-pipett vars spets vidrör väggen i röret: iodixanol bör utvisas från pipetten långsamt och kontinuerligt. Som vektor partiklarna ansamlas i 40% iodixanol lagret, måste vidtas för att säkerställa att de gradient gränssnitt inte blanda20. Slutligen bör det bråk som innehåller vektorn återvinnas genom införandet av en rostfritt stål trubbig nål med en mätare som inte är större än 20 G. För att maximera vektor återhämtning, ska tydlig bråket hämtas i sin helhet. Under detta steg är timing kritisk. För att undvika att äventyra renheten av preparatet, är det viktigt att stoppa samlingen innan andra (kontaminerande) faser av övertoningen samlas.
Skillnader i erhållna vektor titern kan också hänföras till vektorn inneboende förmåga att producera paketerade partiklar. En jämförelse mellan olika AAV serotyper visade att vissa AAV vektorer är svårare att producera en högre titer än andra (t.ex. AAV2)41. Nederbörd vektorns under avsaltning steg, kan vara en möjlig orsak till en lägre titer och förebyggas enkelt genom att undvika överkoncentration33. Dessutom är det också möjligt att av iodixanol gradient-baserade reningens effektivitet skiljer sig något mellan serotyper och, därför, avvikelser i titern erhålls med olika serotyper kan observeras41.
Slutligen måste det påpekas att även om qPCR är en mycket noggrann metod för DNA kvantifiering vissa inneboende variabilitet i tekniken kan observeras. Noggrannhet i titreringen beror primärt på exakt pipettering och ordentlig vortexa av alla lösningar. För att garantera den mest exakta titer läsning, qPCR självständigt kan upprepas, och erhållna medelvärdet. Valet av primers som presenteras i detta protokoll är baserat på sekvens av CBA arrangören ligger i pTransgene plasmiden används i vårt laboratorium. CBA arrangören är en stark syntetisk arrangören som används mycket i fältet vektor att driva uttryck över flera celltyper. Den innehåller flera element, inklusive cytomegalovirus (CMV) tidig enhancer elementet; arrangören, första exon och den första intron av CBA genen; och den skarv acceptorn av den kanin β-globingenen. Primers kan dock utformas för praktiskt taget alla element som ligger inom uttryck kassetten (inklusive promotorn, transgenens och reglerande element). Jämförelse av titer över partier är också möjligt, att tillhandahålla primers används mot regioner vanligt att vektorerna i fråga.
Avslutningsvis kan detta protokoll användas för att producera AAV vektorer med en mängd förhoppningsvis, genomet konfigurationer, promotorn typer och transgenens laster. Detta gör att användare att enkelt anpassa sin vektorer till bästa experimentella behov slutliga egenskaper. I exemplet presenteras i de representativa resultat, användning av PHP. B kapsid, som effektivt korsar BBB, gav högeffektiva genuttryck i CNS, följande svans ven injektion32. Systemisk administrering av CNS penetrant vektorer har avsevärda fördelar när det gäller eventuella biverkningar2,17,32. Ett möjligt alternativ till perifera injektion, samtidigt som man undviker förbehåll av invasiva tekniker, är intratekal leverans, som består av leverans av AAV vektorn i ryggmärgsvätskan. Denna leverans rutt är visat sig vara effektiva, visar utbredd uttryck för transgenens hela CNS, mindre off-target effekter i perifera organ, och låga nivåer av immunsvar42. Intratekala injektioner är dock mycket mer utmanande, eftersom de kräver högre tekniska färdigheter än svans ven injektion.
Kapsid vidareutveckling att förfina denna teknik kommer att drivas av möjligheterna för AAV vektor användning i gen terapi program. Sådana tillvägagångssätt erbjuder attraktiva möjligheter att behandla för närvarande obotliga CNS-störningar, såsom amyotrofisk lateral skleros, Charcot-Marie-Tooth sjukdom, Parkinsons sjukdom och Alzheimers sjukdom18.
The authors have nothing to disclose.
M.R. stöds av en Fonds voor yrkesverksamma Onderzoek Vlaanderen (CVE) postdoktorsstipendium (133722/1204517N) och erkänner ett kontinuerligt stöd för Fundación hjärt-de Colombia administrativa Department of Science, Teknik och Innovation (Grant CT-FP44842-307-2016, Projektkod 656671250485). M.M. stöds av ett CVE doktorand stipendium (1S48018N). M.G.H. stöddes av en VIB institutionella grant och externt stöd från Thierry Latran Foundation (SOD-VIP), Stiftelsen för Alzheimerforskningen (SAO-FRA) (P #14006), FWO (Grant 1513616N) och den Europeiska forskningsrådet (ERC) (Starting Grant 281961 – AstroFunc; Bevis på konceptet Grant 713755 – AD-VIP). Författarna erkänner Jeason Haughton för hans hjälp med musen djurhållning, Stephanie Castaldo för hennes hjälp med att utföra svans ven injektionerna och Caroline Eykens för att ge bilder av transfekterade HEK293T celler. M.G.H. erkänner Michael Dunlop, Peter Hickman och Dean Harrison.
Plasmid production | ||||
pTransgene plasmid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pCapsid | De novo design or obtained from a plasmid repository | N/A | See step 1 of main protocol for further details | |
pHelper | Agilent | 240071 | ||
Plasmid Plus maxi kit | Qiagen | 12963 | ||
QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | ||
AAV Helper-Free System | Agilent | 240071 | ||
Cell culture and transfection | ||||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose, no glutamine | Life technologies | 11960-044 | Supplement DMEM with FBS (1% or 10% v/v) and GlutaMAX 200 mM (1% v/v) then filter sterilize the medium using a 0.22 mm filter | |
Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10500-064 | ||
GlutaMAX supplement | GIBCO | 35050038 | ||
(200 mM) | ||||
Corning bottle-top vacuum filter system | Sigma-Aldrich | CLS430769 | ||
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) with no calcium and no magnesium | GIBCO | 14190094 | ||
HEK293T cells | American Tissue Culture Collection | CRL3216 | Upon receipt, thaw the cells and culture as described in the protocol. After a minimal number of passages, freeze a subfraction for future in aliquots. Always use cells below passage number 20. Once cultured cells have been passaged more than 20 times, restart a culture from the stored aliquots | |
Cell culture dishes | Greiner Cellstar | 639160 | 15 cm diameter culture dishes | |
Cell scrapers | VWR | 10062-904 | ||
Polyethylenimine (PEI) | Polyscience | 23966-2 | PEI in powder form is dissolved at 1 µg/µL in deionized water (ddwater) at pH=2 (use HCl). Prepare in a beaker and stir for 2-3 h. When dissolved, bring the pH back to 7 with NaOH. Filter sterilize and store the resuspended stock solution in 1 ml aliquots at -20 °C. PEI aliquots can freeze/thawed multiple times. | |
Virkon solution | Fisher Scientific | NC9821357 | Disinfect any material that has been in contact with assembled viral particles with Virkon solution | |
Mutexi long-sleeve aprons | Fisher Scientific | 11735423 | Wear an apron over the top of a regular lab coat | |
Fisherbrand maximum protection disposable overshoes | Fisher Scientific | 15401952 | ||
AAV Purification and desalting | ||||
Optiprep density gradient medium | Sigma-Aldrich | D1556 | Optiprep is a 60% (w/v) solution of iodixanol in water (sterile). CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Phenol red | Sigma-Aldrich | P0290 | CAUTION. Use under a laminar flow hood | |
Pasteur pipette | Sigma-Aldrich | Z627992 | Sterilize before use | |
OptiSeal Polypropylene tubes | Beckman | 361625 | ||
Benzonase (250 U/µL) | Sigma-Aldrich | E1014 | Supplied as a ready-to-use solution | |
Acrodisc syringe filter | Pall corporation | 4614 | ||
Omnifix syringe (5mL) | Braun | 4617053V | ||
Blunt syringe needle | Sigma Aldrich | Z261378 | Stainless steel 316 syringe needle, pipetting blunt 90° tip gauge 16, L 4 in. Referred to in the text as a blunt-end needle | |
Aqua Ecotainer | B. Braun | 0082479E | Sterile endotoxin-free water. Referred to as 'Ultrapure water' | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Millipore | UFC910024 | These filters concentrate the final product by collecting the viral particles in consecutive centrifugation steps | |
Pluronic F68 (100X) | Thermo Fisher | 24040032 | Non-ionic surfactant. Dilute in sterile PBS to use at 0,01% (v/v) | |
Fisherbrand Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps (2 mL) | Fisher Scientific | 02-681-374 | Use skirted tubes for easy handling | |
AAV Titration | ||||
Restriction enzyme: StuI (10 U/µL) | Promega | R6421 | ||
DNAse I (1 U/µL) | Fisher scientific | EN0521 | ||
Proteinase K | Sigma-Aldrich | 3115852001 | Reconstitute in ultrapure water and use at a final concentration of 10 mg/ml. Solution can be stored at -20°C | |
EasyStrip Plus Tube Strips (with attached caps) | Fisher scientific | AB2000 | ||
Eppendorf microtube 3810x | Sigma-Aldrich | Z606340-1000EA | ||
LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix | Roche | 4707516001 | ||
LightCycler Multiwell Plates, 96 wells | Roche | 4729692001 | White polypropylene plate (with unique identifying barcode) | |
Microseal 'A' PCR Plate and PCR Tube Sealing Film | Bio-Rad | msa5001 | ||
AAV Purity control | ||||
Ammonium persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | A3678 | Reconstitute in ultrapure water to 10% (v/v). CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Tris Base ULTROL Grade | Merck | 648311 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
UltraPure Agarose | Thermo Fisher | 16500-500 | ||
Rotiphorese® Gel 30 (37,5:1) | Carl Roth | 3029.3 | Aqueous 30 % acrylamide and bisacrylamide stock solution at a ratio of 37.5:1. CAUTION. Use under laminar flow hood. Wear gloves | |
Serva Blue G | Sigma-Aldrich | 6104-58-1 | ||
Precision Plus prestained marker | Bio-Rad | 1610374edu | ||
1-Butanol | Sigma-Aldrich | B7906 | CAUTION. Use under a laminar flow hood. Wear gloves | |
Immunohistochemistry | ||||
Rabbit anti-GFP | Synaptic System | 132002 | 1:300 dilution | |
Anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21206 | 1:1000 dilution | |
Equipment | Company | Catalog number | Comments | |
Vector production lab | ||||
Rotina 380 bench-top centrifuge * | Hettich | 1701 | ||
Optima XPN 80 ultracentrifuge * | Beckmann Coulter | A95765 | ||
Type 50.2 Ti fixed-angle titanium rotor * | Beckmann Coulter | 337901 | ||
Entris digital scale * | Sartorius | 2202-1S | ||
Warm water bath * | Set at 37°C | |||
Ice bucket * | VWR | 10146-290 | Keep material used in the vector production lab separate from that used in standard lab areas | |
Pipetboy pro * | Integra | 156,400 | ||
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes: Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | Capacity of 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Co2 incubator CB150 * | Binder | 9040-0038 | Set at 37°C, 5% CO2 and 95% humidity | |
Nuaire safety cabinet NU 437-400E * | Labexchange | 31324 | Clean all the surfaces with 70% ethanol and Virkon before and after use | |
Conventional lab | ||||
T100 thermal cycler * | Bio-Rad | 1861096 | ||
LightCycler 480 Instrument II * | Roche | 5015278001 | ||
ThermoMixer * | Eppendorf | C 5382000015 | ||
Nanodrop * | ThermoFisher Scientific | ND 2000 | ||
Mini-Protean Tetra Cell* | Bio-Rad | 1658001FC | For use with handmade or precast gels | |
ProteoSilver silver stain kit | Sigma-Aldrich | PROTSIL1 | High sensitivity protein detection with low background | |
Centrifuge 5804 R * | Eppendorf | B1_022628045 | High speed centrifuge for medium capacity needs (up to 250 ml) | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 606180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 607180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Graduated pipettes Cell star * | Greiner bio-one | 760180 | 5 ml, 10 ml and 25 ml | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 750257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 738257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Filter tips * | Greiner bio-one | 771257 | 2 µl, 20 µl, 200 µl | |
Ice bucket with lid * | VWR | 10146-290 | ||
Mini diaphragm vacuum pump, VP 86 * | VWR | 181-0065 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F144801 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123600 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123615 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123601 | ||
Pipetman P2, P20, P100, P200, P1000 | Gilson | F123602 | ||
* Materials marked with an asterisk are expensive vpieces of equipment and are usually central infrastructure items shared between multiple labs. These items can also be replaced by equivalents if available. Note, when a different ultracentrifuge is used, care must be taken to select the correct rotor and centrifuge tubes. |