Misurare la forma e la dimensione delle particelle di fango attivo immobilizzato in Agar con una Pipeline di Software Open Source

Summary

Le dimensioni e la forma delle particelle a fanghi attivi sono parametri importanti che sono misurati utilizzando metodi diversi. Imprecisioni derivano da campionamento non rappresentativo, immagini non ottimali e parametri di analisi soggettiva. Per ridurre questi errori e facilitare la misurazione, presentiamo un protocollo specificando ogni passo, tra cui una pipeline software opensource.

Abstract

Bioreattori sperimentale, come ad esempio quelli trattamento delle acque reflue, contengono particelle la cui dimensione e la forma sono parametri importanti. Ad esempio, la dimensione e la forma di fiocchi di fango attivo può indicare le condizioni a Microscala e anche direttamente influenzare quanto bene il fango si deposita in un chiarificatore.

Forma e dimensione delle particelle sono entrambe le misurazioni misleadingly ‘semplice’. Molti problemi sottili, spesso non indirizzate in protocolli informali, possono sorgere quando campionamento, imaging e l’analisi di particelle. Metodi di campionamento possono essere prevenuti o non forniscono sufficiente potenza statistica. I campioni stessi potrebbero essere mal conservati o subiscono alterazione durante immobilizzazione. Immagini non siano di qualità sufficiente; sovrapposizione di particelle, profondità di campo, il livello di ingrandimento e vari rumori possono tutti producono scarsi risultati. Analisi scarsamente specificata possono introdurre bias, come quella prodotta dalla segmentazione e soglia manuale dell’immagine.

Convenienza e velocità effettiva sono desiderabili al fianco di riproducibilità. Un metodo conveniente, alta velocità di trasmissione può consentire più frequente misurazione delle particelle, producendo molte immagini contenenti migliaia di particelle. Un metodo che utilizza reagenti poco costosi, un comune microscopio da dissezione e software di analisi di open source disponibile liberamente permette risultati sperimentali ripetibili, accessibili, riproducibili e parzialmente automatizzata. Inoltre, il prodotto di tale metodo può essere ben formattato, ben definito e facilmente comprensibili dal software di analisi dati, sia all’interno del laboratorio analisi e condivisione dei dati tra laboratori di interpolazione.

Vi presentiamo un protocollo che descrive in dettaglio i passaggi necessari per produrre un prodotto del genere, tra cui: campionamento, campione preparazione e immobilizzazione in agar, acquisizione di immagini digitali, analisi digitale delle immagini ed esempi di generazione specifico esperimento figura dalla risultati dell’analisi. Abbiamo anche incluso una pipeline di analisi di dati open source per supportare questo protocollo.

Introduction

Lo scopo di questo metodo è quello di fornire un metodo ben definito, ripetibile e parzialmente automatizzata per determinare le distribuzioni di dimensioni e forma delle particelle in bioreattori, specialmente quelli che contengono flocculi di fanghi e aerobica granuli^{1 , 2}. la spiegazione razionale dietro questo metodo erano per migliorare l’accessibilità, la semplicità, la velocità effettiva, e ripetibilità delle nostre esistente di protocolli interni^3,4, facilitare la misurazione delle particelle per gli altri e facilitare la condivisione e confronto dei dati.

Ci sono due grandi categorie di analisi di misurazione delle particelle – Metodi inferenziali e direct imaging utilizzando tali qualità come dispersione della luce⁵. Sebbene metodi di verosimiglianza possono essere automatizzati e hanno grande velocità effettiva, l’attrezzatura è costosa. Inoltre, mentre metodi di verosimiglianza possono determinare con precisione la dimensione equivalente di una particella⁶, non forniscono informazioni dettagliate forma⁷.

A causa della necessità per i dati di forma, abbiamo basato il nostro metodo su formazione immagine diretta. Mentre esistono alcuni metodi di imaging ad alta velocità, essi hanno tradizionalmente richiesto costosi hardware commerciale o soluzioni personalizzate costruito^8,9. Il nostro metodo è stato sviluppato per impiegare hardware comune, accessibile e software che, anche se soffre di una riduzione nella capacità produttiva, produce immagini di particelle molto più rispetto al minimo necessario per molte analisi¹⁰.

I protocolli esistenti non possono specificare importante campionamento e procedura di acquisizione immagine. Altri protocolli possono specificare passaggi manuali che introducono pregiudizi soggettivi (ad esempio ad hoc Sogliatura¹¹). Un metodo ben definito che specifica campionatura, immobilizzazione e immagine acquisizione passaggi combinati con software di analisi liberamente disponibile migliorerà sia all’interno del laboratorio immagine analisi e comparazioni tra i laboratori. Degli obiettivi principali di questo protocollo è quello di fornire un flusso di lavoro e strumenti che dovrebbero portare a risultati riproducibili da laboratori diversi per lo stesso esempio.

Oltre a normalizzare il processo di analisi di immagine, i dati prodotti da questa pipeline viene registrati in una ben definita e ben formattato file¹² adatto per l’uso di dati popolari analisi pacchetti^13,14, esperimento di interpolazione analisi specifiche (ad esempio di generazione personalizzata figura) e facilitare condivisione dei dati tra laboratori.

Questo protocollo è suggerito specialmente per i ricercatori che richiedono dati di forma delle particelle, non hanno accesso a metodi di verosimiglianza, non si desiderano sviluppare la propria pipeline di analisi di immagine e desiderano condividere i loro dati facilmente con gli altri

Protocol

1. raccogliere campioni per analisi delle particelle Determinare il volume del campione per i reattori specifici che produrrà sufficiente particelle per analisi statistica10 (> 500), evitando la sovrapposizione delle particelle. Si supponga che una gamma di 0,5-2 mL per campione di liquore misto è sufficiente per i campioni di fango attivo con un solidi misti liquore sospesa (MLSS) tra 250 e 5.000 mg/L. In caso contrario, preparare tre piastre di agar di prova utiliz…

Representative Results

File generatiIl processo illustrato nella Figura 1 produrrà due file per ogni immagine analizzati. Il primo file è una virgola separati file di testo (CSV) di valore dove ogni riga corrisponde a una singola particella e le colonne descrivono vari criteri di misurazione delle particelle come zona, circolarità e solidità e definiti nel manuale ImageJ17. I file CSV di esempio sono inclusi come informazioni supplem…

Discussion

Anche se il sistema di analisi dell’immagine è abbastanza robusto e QC sono misure per garantire immagini poveri vengono rimossi, giusta attenzione per i problemi specifici nel campionamento, preparazione e acquisizione di immagini può migliorare sia la precisione dei dati e la proporzione di immagini passando QC.

Concentrazione di campionamento
Supponendo che è stato prelevato un campione rappresentativo, il passo più importante è quello di garantire la presenza per a…

Materials

10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.