O tamanho e forma das partículas em lamas activadas são parâmetros importantes que são medidos através de diferentes métodos. Imprecisões decorrem de amostragem não-representativo, imagens de qualidade inferior e parâmetros de análise subjetiva. Para minimizar esses erros e facilitar a medição, apresentamos um protocolo especificando cada passo, incluindo um pipeline de software de código aberto.
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Artigo de método
Medindo a forma e o tamanho das partículas de lodo ativado imobilizada em ágar com um Pipeline de Software de código aberto
Neste artigo
Resumo
Resumo
Biorreatores experimentais, tais como aqueles tratamento de águas residuais, contêm partículas cujo tamanho e forma são parâmetros importantes. Por exemplo, o tamanho e a forma de flocos de lodo ativado podem indicar as condições para a microescala e também diretamente afetar bem como o lodo se instala um clarificador.
Forma e tamanho de partícula são as duas medições enganadoramente 'simples'. Muitas questões sutis, muitas vezes sem resposta nos protocolos informais, podem surgir quando a amostragem de imagem e análise de partículas. Métodos de amostragem podem ser tendencioso ou não fornecem energia suficiente estatística. As amostras se podem ser mal conservadas ou sofrem alteração durante a imobilização. As imagens podem não ser de qualidade suficiente; sobreposição de partículas, profundidade de campo, nível de ampliação e vários ruído pode tudo produzir maus resultados. Análise mal especificado pode apresentar viés, como que produzido por limiarização de imagem manual e segmentação.
Acessibilidade e throughput são desejáveis ao lado de reprodutibilidade. Um método acessível, alta taxa de transferência pode permitir mais frequente medição de partículas, produzindo muitas imagens contendo milhares de partículas. Um método que utiliza reagentes de baixo custo, um microscópio comum de dissecação e software de análise de código aberto disponível gratuitamente permite resultados experimentais repetíveis, acessíveis, reprodutíveis e parcialmente automatizada. Além disso, o produto de tal método pode ser bem formatada, bem definidos e facilmente compreendida pelo software de análise de dados, facilitando as análises em laboratório e dados de compartilhamento entre laboratórios.
Apresentamos um protocolo em que detalha os passos necessários para produzir um produto desse tipo, incluindo: amostragem, preparação e imobilização em ágar, aquisição de imagem digital, análise de imagem digital e exemplos de geração de experiência específica figura da amostra a resultados da análise. Nós também incluímos um pipeline de análise de dados de código aberto para suportar este protocolo.
Introdução
A finalidade desse método é fornecer um método bem definido, repetível e parcialmente automatizada para determinar as distribuições de tamanho e forma das partículas em biorreatores, particularmente aqueles que contêm flocos de lodo ativado e grânulos aeróbio1 , 2. a lógica por trás deste método melhorar a acessibilidade, a simplicidade, a taxa de transferência e, repetibilidade dos nossos actuais protocolos in-house3,4, facilitar a medição de partículas para os outros e facilitar a partilha e comparação de dados.
Existem du....
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Protocolo
1. coletar amostras para análise de partículas
- Determinar o volume de amostra de reatores específicos que irá produzir partículas suficientes para análise estatística10 (> 500), evitando a sobreposição de partícula.
- Suponha que um intervalo de 0,5 a 2 mL por amostra do licor misto é suficiente para as amostras de lodo ativado com sólidos um licor misto suspenso (saudades) entre 250 e 5.000 mg/L.
- Caso contrário, prepare-se três placas de ágar de teste usando 0.5, 2 e 5 mL de amostra (etapas 1.2 através de 2.7).
- Visualmente, estimar quais (se houver) volumes de amostra melhores atendem aos critérios listado....
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Resultados
Arquivos gerados
O processo ilustrado na Figura 1 produzirá dois arquivos por imagem analisados. O primeiro arquivo é uma vírgula separados arquivo de texto CSV (valores) onde cada linha corresponde a uma partícula individual e as colunas descrevem várias métricas de partículas, tais como área, circularidade e solidez e definidos no manual o ImageJ.17. Arquivos CSV de exemplo estão incluídos como informação suplemen.......
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Discussão
Embora o sistema de análise de imagem é bastante robusto e QC medidas para assegurar imagens pobres são removidas, devida atenção a questões específicas na amostragem, preparação de chapa e aquisição de imagens pode melhorar tanto a precisão dos dados e a proporção de imagens passando QC.
Concentração de amostragem
Supondo que tomou-se uma amostra representativa, o passo mais importante é assegurar a partículas suficientes para análise eficiente e representativo
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por um subsídio da National Science Foundation CBET 1336544.
Os logotipos de FIJI, R e Python são usados com a em conformidade com as seguintes diretivas de marca:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , conforme a licença CC-BY-SA 4.0 listada em: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fiji: https://imagej.net/Licensing
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Solução de alvejante a 10% | Chlorox | 31009 | Para desinfecção do espaço de trabalho. |
| Tubo de centrífuga de 15 mL com tampa | Corning | 430790 | Por amostra. |
| Frasco Erlenmeyer de 50 mL | Corning | 4980-50 | Outros recipientes são adequados, desde que possam conter > 40 mL de amostra e permitir a mistura |
| de 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Ou de outra forma suficiente para o manuseio de ágar |
| Agar | BD | 214010 | Sólido, para preparar gel a 7,5%. 7 mL por amostra. |
| Software de análise de dados | N/A | N/A | R ou Python são sugeridos |
| Água deionizada | N/A | N/A | Suficiente para preparar corante e ágar. Se não estiver disponível, toque em deve estar bem. |
| Computador desktop | N / A | N / A | A análise de imagem não consome muita CPU, qualquer computador desktop 'comum' por volta de 2017 deve ser suficiente. |
| Disco rígido externo | Seagate | STEB5000100 | Não é totalmente necessário, mas extremamente útil dado o número e o tamanho das imagens. 2 ou mais TB de armazenamento sugeridos. |
| versão 1.51d | do FIJI | NIH | é o núcleo do ImageJ. Os plug-ins são atualizados no momento da escrita. Disponível em: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | versão 2.19.1 ou posterior | Disponível em: https://git-scm.com/ |
| Software de captura de imagem | ToupView | versão 3.7.5177 | Qualquer compatível com a câmera, pode vir com a câmera. Deve permitir salvar imagens TIFF com dados de calibração espacial. |
| Platina Mecânica (X/Y) | OMAX | A512 | Não é totalmente necessário, mas ajuda muito na aquisição de imagens. |
| Azul de metileno | Fisher | M291-100 | Solid, para preparar solução a 1% p/v. Solução de 5 uL por amostra. |
| Câmera para microscópio | OMAX | A35140U | Qualquer câmera digital compatível com microscópio. Sugere-se uma resolução que forneça pelo menos 5 um por pixel com ampliação de 10x e uma faixa dinâmica de pelo menos 8 bits por pixel por canal de cor. |
| Micrômetro de estágio óptico | OMAX | A36CALM1 | Ou de outra forma suficiente para calibração espacial. |
| Placa de Petri, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 por amostra. |
| PPE | N/A | N/A | Jaleco, luvas e óculos padrão. |
| Sparmoria macro | NCSU | versão 0.2.1 | Disponível no repositório github: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Microscópio estéreo/dissecação | Nikon | SMZ-2T | Deve fornecer ampliação de 10 a 20x e permitir fotos digitais com uma câmera embutida ou um ponto de montagem para um CCD. |
Referências
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -J., Show, K. -Y., Tay, J. -H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26
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Reimpressões e permissões
