Mätning av form och storlek av aktiverat slam partiklar orörlig i Agar med en Open Source programvara Pipeline

Summary

Storleken och formen av partiklar i det aktiva slammet är viktiga parametrar som mäts med olika metoder. Felaktigheter uppkommer icke-representativ provtagning, suboptimal bilder och subjektiva analysparametrar. För att minimera felen och underlätta mätning, presenterar vi ett protokoll som anger varje steg, inklusive en öppen källkod programvara gasledning.

Abstract

Experimentell bioreaktorer, såsom de behandlande avloppsvattnet, innehålla partiklar vars storlek och form är viktiga parametrar. Exempelvis kan storlek och form av aktiverat slam flockar ange villkor på den hur provtagningsutrustningen skall, och också direkt påverka hur väl slammet bosätter sig i en Hårblekningsmedel.

Partikelstorlek och form är både misleadingly ‘enkla’ mätningar. Många subtila frågor, ofta oadresserade i informella protokoll, kan uppstå när provtagning, imaging och analysera partiklar. Provtagning kan vara partisk eller ger inte tillräcklig statistisk power. Proverna som själva kan vara dåligt bevarad eller genomgå en förändring under immobilisering. Bilder får inte vara av tillräckligt god kvalitet; överlappande partiklar, kan skärpedjup, förstoringsgrad, och olika buller alla ger dåliga resultat. Dåligt specificerad analys kan införa bias, såsom som produceras av manuell bild tröskelvärde och segmentering.

Överkomliga priser och genomströmning är önskvärda vid sidan av reproducerbarhet. En prisvärd, hög genomströmning metod kan aktivera oftare partikel mätning, producerar många bilder som innehåller tusentals partiklar. En metod som använder billig reagenser, gemensamma dissekera mikroskopet och fritt tillgängliga open source analys programvara tillåter repeterbara, tillgänglig, reproducerbar och delvis automatiserad experimentella resultat. Produkten av en sådan metod kan dessutom vara väl formaterad, väldefinierade och lätt att förstå av data analysprogram, lätta både inom-lab analyser och delning av data mellan labs.

Vi presenterar ett protokoll som beskriver de steg som behövs för att producera sådan produkt, inklusive: provtagning, prov förberedelse och immobilisering i agar, digital bild förvärv, digital bildanalys och exempel på experiment-specifik figur generationen från den analysresultat. Vi har även inkluderat en öppen källkod data analys pipeline till stöd för detta protokoll.

Introduction

Syftet med denna metod är att ge en väldefinierad, repeterbara och delvis automatiserad metod för att bestämma storlek och form distributioner av partiklar i bioreaktorer, särskilt de som innehåller aktiva slammet flockar och aerob granulat^{1 , 2}. tanken bakom denna metod var att öka köpkraften, enkelhet, genomströmning, och repeterbarhet av våra befintliga interna protokoll^3,4, underlätta partikel mätning för andra, och underlätta delning och jämförelse av data.

Det finns två huvudkategorier av partikel mätning analys – direct imaging och inferential metoder med sådana egenskaper som ljusspridning⁵. Även om inferential metoder kan automatiseras och har stor genomströmning, är utrustningen dyra. Dessutom, medan inferential metoder kan exakt bestämma motsvarande storleken på en partikel⁶, ger de inte detaljerad form information⁷.

På grund av behovet för formdata, har vi grundat vår metod på direct imaging. Medan vissa hög genomströmning avbildningsmetoder existerar, har de traditionellt krävs antingen dyr kommersiell hårdvara eller anpassade byggda lösningar^8,9. Vår metod har utvecklats för att anställa gemensamma, prisvärda maskinvara och programvara som, även om lider av en minskning av genomströmning, producerar mycket mer partikel bilder än det minimum som krävs för många analyser¹⁰.

Befintliga protokoll kan inte ange viktiga provtagning och bild förvärv steg. Andra protokoll kan ange manuella steg att inför subjektiva bias (såsom ad hoc-tröskelvärde¹¹). En väldefinierad metod som anger provtagning, immobilisering och bild förvärv steg kombineras med fritt tillgängliga analysprogramvara kommer att förbättra både inom-lab bildanalys och jämförelser mellan laboratorier. Ett viktigt mål i detta protokoll är att ge ett arbetsflöde och verktyg som ska leda till reproducerbara resultat från olika laboratorier för samma prov.

Bortsett från normaliserad bild analysprocessen, registreras data produceras av denna rörledning i en väldefinierad, väl formaterad fil¹² lämplig för användning av populära data analys paket^13,14, lätta experiment specifika analyser (såsom anpassade figur generation) och underlätta delning av data mellan labs.

Detta protokoll föreslås särskilt för forskare som kräver partikel formdata, har inte tillgång till inferential metoder, vill inte utveckla sin egen bild analys pipeline, och vill dela sin data med andra

Protocol

1. samla in prover för Partikelanalys Avgöra provvolymen för specifika reaktorer som kommer att producera tillräckligt partiklar för statistisk analys10 (> 500) samtidigt undvika partikel överlappning. Anta att en rad 0,5 till 2 mL per prov av blandade sprit räcker för aktiva slammet prover med en blandad sprit Suspenderade fasta ämnen (MLSS) mellan 250 och 5.000 mg/L. Annars, förbereda tre test agarplattor använder 0,5, 2 och 5 mL av provet (steg 1.2 genom …

Representative Results

Filer som genererasProcessen illustreras i figur 1 kommer att producera två filer per bild analyseras. Den första filen är ett kommatecken separerad textfil (SKV-filer) där varje rad motsvarar en enskild partikel och i kolumner beskrivs olika partikel mätvärden såsom område, loopkontroll och soliditet och definieras i ImageJ manuell17. Exempel CSV-filer ingår som tilläggsinformation och i katalogen exempe…

Discussion

Även om systemets bild analys är ganska robust och QC åtgärder vidtas för att säkerställa att fattiga bilder tas bort, kan ordentlig uppmärksamhet på specifika frågor i provtagning, plattan förberedelse och bild förvärv förbättra både riktigheten av uppgifter och andelen bilder passerar QC.

Provtagning koncentration
Förutsatt att ett representativt prov har tagits, är det viktigaste steget att säkerställa att tillräcklig partiklar finns för representat…

Materials

10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.