Messung von Form und Größe der Belebtschlamm Partikel unbeweglich in Agar mit einer Open-Source-Software-Pipeline
Summary
Die Größe und Form der Partikel im Belebtschlamm sind wichtige Parameter, die mit unterschiedlichen Methoden gemessen werden. Ungenauigkeiten ergeben sich aus nicht-repräsentative Probenahme, suboptimalen Bildern und subjektive Analyseparameter. Um diesen Fehler zu minimieren und Messung zu erleichtern, präsentieren wir ein Protokoll angeben, jeden Schritt, einschließlich einer open-Source-Software-Pipeline.
Abstract
Experimentelle Bioreaktoren, wie z. B. die Behandlung von Abwasser enthalten Partikel, deren Größe und Form wichtige Parameter sind. Beispielsweise können die Größe und Form des Belebtschlammes Flocken geben die Bedingungen an den Microscale und auch direkt beeinflussen, wie gut der Schlamm in einem Nachklärbecken absetzt.
Partikelgröße und-Form sind beide fälschlich “einfachen” Messungen. Viele subtile Probleme, oft unadressierte in informelle Protokolle können entstehen, wenn Probenahme, Bildgebung und Partikel zu analysieren. Probenahmeverfahren voreingenommen sein können oder nicht genügend statistische Strom liefern. Die Proben selbst können nur schlecht erhalten oder Veränderung während der Ruhigstellung zu unterziehen. Bilder möglicherweise nicht von ausreichender Qualität sind; überlappende Partikel, produzieren Schärfentiefe, Vergrößerungsstufe, und verschiedene Geräusche alle schlechte Ergebnisse. Schlecht spezifizierten Analyse kann Vorurteile, wie durch die manuelle Bild Schwellwerte und Segmentierung einführen.
Erschwinglichkeit und Durchsatz sind neben Reproduzierbarkeit wünschenswert. Eine erschwingliche, hoher Durchsatz-Methode können häufigere Partikel Messung, viele Bilder, die mit Tausenden von Partikel produzieren. Eine Methode, die preiswerte Reagenzien, eine gemeinsame sezierenden Mikroskop und frei verfügbaren open-Source-Analyse-Software ermöglicht wiederholbare, zugänglich, reproduzierbare und teilweise automatisiert Versuchsergebnisse. Darüber hinaus kann das Produkt einer solchen Methode gut formatierte, klar definierte und Datenanalyse-Software, Lockerung in Laboranalysen und Datenaustausch zwischen den Labors leicht verständlich sein.
Präsentieren wir eine Protokoll, das beschreibt die notwendigen Schritte um solch ein Produkt herzustellen, einschließlich: probieren, probieren, Vorbereitung und Immobilisierung in Agar, digitale Bildaufnahme, digitale Bildanalyse und Beispiele der Experiment-spezifische Abbildung Generation aus der die Ergebnisse der Analyse. Wir haben auch eine Open-Source-Daten-Analyse-Pipeline für dieses Protokoll aufgenommen.
Introduction
Der Zweck dieser Methode ist, eine klar definierte, reproduzierbare und teilweise automatisiert Verfahren zur Bestimmung der Größe und Form-Distributionen von Partikeln in Bioreaktoren, besonders diejenigen mit Belebtschlamm Flocken und aerobe Granulat1 , 2. waren die Beweggründe für diese Methode zur Verbesserung der Erschwinglichkeit, Einfachheit, Durchsatz und Wiederholbarkeit unserer bestehenden internen Protokollen3,4, Partikel-Messung für andere zu erleichtern und Austausch erleichtern und Vergleich der Daten.
Es gibt zwei große Kategorien von Messung Partikelanalyse – direct imaging und schlussfolgernde Methoden mit solchen Qualitäten als Lichtstreuung5. Obwohl folgernd Methoden automatisiert werden können und großen Durchsatz haben, ist die Ausrüstung teuer. Darüber hinaus während folgernd Methoden der gleicher Größe eines Teilchens6genau bestimmen können, bieten sie keine detaillierte Form Informationen7.
Wegen der Notwendigkeit der Shape-Daten haben wir unsere Methode auf direkte Bildgebung basiert. Während einige Hochdurchsatz-bildgebenden Verfahren vorhanden sind, müssen sie traditionell entweder teure kommerzielle Hardware oder Sonderlösungen gebauten8,9. Unsere Methode wurde entwickelt, um gemeinsame, kostengünstige Hardware und Software, die zwar eine Reduzierung des Durchsatzes, leiden weit mehr Partikelbilder als das Minimum für viele Analysen10benötigt produziert zu beschäftigen.
Bestehende Protokolle können keinen wichtigen Probenahme und Bild Erwerb Schritte angeben. Andere Protokolle können manuelle Schritte angeben, die subjektive Voreingenommenheit (z. B. ad-hoc-Schwellwerte11) einzuführen. Eine klar definierte Methode, die Probenahme, Immobilisierung und Bild Erwerb Schritte kombiniert mit frei verfügbaren Analysesoftware angibt wird im Labor Bildanalyse und Vergleiche zwischen den Labors verbessern. Ein wesentliches Ziel dieses Protokolls ist, einen Workflow und Tools, die aus verschiedenen Labors für die gleiche Probe zu reproduzierbaren Ergebnissen führen sollten.
Neben der Normalisierung des Analyseprozesses Bild, werden die Daten durch diese Pipeline produziert in einem klar definierten, gut formatierte Datei12 geeignet für den Einsatz von beliebten Daten Analyse Pakete13,14, Lockerung Experiment aufgezeichnet. spezifische Analysen (z. B. benutzerdefinierte Zahl Generation) und erleichtern den Datenaustausch zwischen Labors.
Dieses Protokoll wird vor allem für Forscher vorgeschlagen, die Partikel-Shape-Daten benötigen, haben keinen Zugang zu schlussfolgernde Methoden, wollen nicht ihre eigenen Bild-Analyse-Pipeline zu entwickeln, und ihre Daten einfach mit anderen teilen möchten
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl die Bild-Analyse-System ziemlich robust ist und QC Schritte unternommen, um sicherzustellen, dass schlechte Bilder entfernt sind, kann angemessene Aufmerksamkeit auf konkrete Fragestellungen in der Probenahme, Platte Vorbereitung und Bildaufnahme sowohl die Richtigkeit der Daten und der Anteil der verbessern Bilder vorbei QC.
Probenahme-Konzentration
Vorausgesetzt, dass eine repräsentative Probe entnommen worden, ist der wichtigste Schritt um sicherzustellen, dass g…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Science Foundation CBET 1336544 unterstützt.
Die Fidschi-Inseln, R und Python Logos werden mit dem in Übereinstimmung mit den folgenden Markenzeichen-Richtlinien verwendet:
Python: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ , wie pro die CC-BY-SA 4.0 Lizenz aufgelisten: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
Fidschi: https://imagej.net/Licensing
Materials
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
Referências
- Show, K. Y., Lee, D. J., Tay, J. H. Aerobic granulation: Advances and challenges. Applied Biochemistry and Biotechnology. 167 (6), 1622-1640 (2012).
- Adav, S. S., Lee, D. -. J., Show, K. -. Y., Tay, J. -. H. Aerobic granular sludge: Recent advances. Biotechnology Advances. 26 (5), 411-423 (2008).
- Initial Investigations of Aerobic Granulation in an Annular Gap Bioreactor. North Carolina State University Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/2162 (2004)
- . Effect of Hydrodynamics on Aerobic Granulation Available from: https://repository.lib.ncsu.edu/handle/1840.16/8761 (2012)
- Tay, J. H., Liu, Q. S., Liu, Y. Microscopic observation of aerobic granulation in sequential aerobic sludge blanket reactor. Journal of Applied Microbiology. 91 (1), 168-175 (2001).
- Kelly, R. N., et al. Graphical Comparison of Image Analysis and Laser Diffraction Particle Size Analysis Data Obtained From the Measurements of Nonspherical Particle Systems. AAPS Pharm SciTech. 7 (3), E1-E14 (2006).
- Walisko, R., et al. The Taming of the Shrew -Controlling the Morphology of Filamentous Eukaryotic and Prokaryotic Microorganisms. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 149, 1-27 (2015).
- Campbell, R. A. A., Eifert, R. W., Turner, G. C. Openstage: A Low-Cost Motorized Microscope Stage with Sub-Micron Positioning Accuracy. PLoS ONE. 9 (2), e88977 (2014).
- Dias, P. A., et al. Image processing for identification and quantification of filamentous bacteria in in situ acquired images. BioMedical Engineering OnLine. 15 (1), 64 (2016).
- Liao, J., Lou, I., de los Reyes, F. L. Relationship of Species-Specific Filament Levels to Filamentous Bulking in Activated Sludge. Applied and Environmental Microbiology. 70 (4), 2420-2428 (2004).
- Cromey, D. W. Avoiding twisted pixels: ethical guidelines for the appropriate use and manipulation of scientific digital images. Science and Engineering Ethics. 16 (4), 639-667 (2010).
- Wickham, H. Tidy Data. Journal of Statistical Software. 59 (10), (2014).
- van Rossum, G. . Python tutorial. , (1995).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. FIJI: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- . SParMorIA: Sludge Particle Morphological ImageAnalysis Available from: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis (2018)
- Ferreira, T., Rasband, W. . ImageJ User Guide: IJ 1.42 r. , (2012).
- Sezgin, M., Sankur, B. Survey over image thresholding techniques and quantitative performance evaluation. Journal of Electronic Imaging. 13 (1), 146-166 (2004).
- Kröner, S., Doménech Carbó, M. T. Determination of minimum pixel resolution for shape analysis: Proposal of a new data validation method for computerized images. Powder Technology. 245, 297-313 (2013).
- McKinney, W. Data Structures for Statistical Computing in Python. Proceedings of the 9th Python in Science Conference. , 51-56 (2010).
- Waskom, M., et al. . seaborn: v0.5.0 (November 2014). , (2014).
- . dplyr: A Grammar of Data Manipulation Available from: https://cran.r-project.org/web/packages/dplyr/index.html (2016)
- Riley, R. S., Ben-Ezra, J. M., Massey, D., Slyter, R. L., Romagnoli, G. Digital Photography: A Primer for Pathologists. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 18 (2), 91-128 (2004).
- Singh, S., Bray, M. A., Jones, T. R., Carpenter, A. E. Pipeline for illumination correction of images for high-throughput microscopy. Journal of Microscopy. 256 (3), 231-236 (2014).
- Eastwood, B. S., Childs, E. C. Image Alignment for Multiple Camera High Dynamic Range Microscopy. Proceedings. IEEE Workshop on Applications of Computer Vision. , 225-232 (2012).
- High Dynamic Range Microscopy for Cytopathological Cancer Diagnosis. IEEE Journal of Selected Topics in Signal Processing (Special Issue on: Digital Image Processing Techniques for Oncology) Available from: https://www.lfb.rwth-aachen.de/en/ (2009)
- Jain, V., et al. Supervised Learning of Image Restoration with Convolutional Networks. 2007 IEEE 11th International Conference on Computer Vision. , 1-8 (2007).
