Meten van de vorm en grootte van actief slib deeltjes vervoertechnische Agar met een Open Source Software pijpleiding

Summary

De grootte en de vorm van deeltjes in actiefslibinstallatie zijn belangrijke parameters die worden gemeten met behulp van verschillende methoden. Onjuistheden voortvloeien uit niet-representatieve bemonstering, suboptimaal afbeeldingen en subjectieve analyse gebruikte parameters. Om deze fouten te minimaliseren en verlichten van de meting, presenteren we een protocol waarin elke stap, met inbegrip van een pijpleiding van opensource software.

Abstract

Experimentele bioreactoren, zoals deze behandelen afvalwater, bevatten deeltjes waarvan grootte en vorm belangrijke parameters zijn. Bijvoorbeeld, kunnen de grootte en vorm van actief slib Floc geven op welke voorwaarden op de microscale en ook rechtstreeks van invloed op hoe goed het slib vestigt zich in een clarifier.

Deeltjesgrootte en vorm zijn beide bedrieglijk ‘eenvoudige’ metingen. Vele subtiele problemen, vaak ongeadresseerde in informele protocollen, kunnen optreden wanneer bemonstering, imaging en analyseren van de deeltjes. Bemonsteringsmethoden een vertekend beeld kunnen geven of niet genoeg statistische stroomvoorziening. De monsters zelf slecht kunnen worden bewaard of wijziging tijdens immobilisatie ondergaan. Afbeeldingen kunnen niet worden van voldoende kwaliteit; overlappende deeltjes, kan scherptediepte, vergrotingsniveau, en diverse lawaai alle slechte resultaten opleveren. Slecht opgegeven analyse kan leiden tot vertekening, zoals die geproduceerd door handmatige afbeelding drempelmethode en segmentatie.

Betaalbaarheid en doorvoer zijn wenselijk naast reproduceerbaarheid. Een betaalbare, hoge doorvoer methode kunnen vaker meting van de deeltjes, produceren veel afbeeldingen met duizenden deeltjes. Een methode die gebruikmaakt van goedkope reagentia, een gemeenschappelijk ontleden Microscoop, en de software van de analyse van de vrij beschikbare open source kunt herhaalbare, toegankelijk, reproduceerbare en gedeeltelijk geautomatiseerde experimentele resultaten. Verder, het product van een dergelijke methode kunnen well-formatted, welomschreven en gemakkelijk te begrijpen door data-analysesoftware, versoepeling van zowel binnen-lab analyses en gegevens delen tussen labs.

We presenteren een protocol dat de gegevens van de stappen die nodig zijn voor de productie van dergelijk product, met inbegrip van: bemonstering, sample voorbereiding en immobilisatie in agar, digital image aquisition, digitale beeldanalyse en voorbeelden van experiment-specifieke figuur met behulp van de de resultaten van de analyse. We hebben ook een open-source data analyse pijpleiding ter ondersteuning van dit protocol opgenomen.

Introduction

Het doel van deze methode is bedoeld als een welomschreven, herhaalbare en gedeeltelijk geautomatiseerde methode voor het bepalen van de grootte en vorm distributies van deeltjes in de bioreactoren, met name die met actief slib Floc en aërobe korrels^{1 , 2}. de grondgedachte achter deze methode waren om de betaalbaarheid, eenvoud, doorvoer, en herhaalbaarheid van onze bestaande interne protocollen,^3,4, verlichten deeltje meting voor anderen, en vergemakkelijken delen en vergelijking van de gegevens.

Er zijn twee brede categorieën voor de analyse van de meting van de deeltjes – direct beeldvorming en inferentiële methoden met behulp van deze kwaliteiten als lichtverstrooiing⁵. Hoewel inferentiële methoden kunnen worden geautomatiseerd en grote doorvoer hebben, is de apparatuur duur. Bovendien, terwijl de inferentiële methoden kunnen nauwkeurig bepalen het equivalent grootte van een deeltje⁶, bieden ze geen gedetailleerde vorm informatie⁷.

Vanwege de noodzaak van shapegegevens, hebben wij onze methode gebaseerd op directe imaging. Hoewel sommige high-throughput beeldvormende methoden bestaan, moeten ze traditioneel dure commerciële hardware of oplossingen op maat gebouwde^8,9. Onze methode is ontwikkeld om gemeenschappelijk, betaalbare hardware en software die, hoewel lijden aan een afname van de doorvoer, veel meer deeltjes beelden dan het minimum dat nodig is voor veel analyses^{10 produceert}tewerk te stellen.

Bestaande protocollen kunnen niet geven belangrijk bemonsterings- en afbeelding overname stappen. Andere protocollen kunnen handmatige stappen die invoering van subjectieve bias (zoals ad hoc drempelmethode¹¹) opgeven. Een duidelijk omschreven methode waarmee bemonstering, immobilisatie en afbeelding overname stappen gecombineerd met vrij beschikbare analysesoftware zal verbeteren zowel binnen-lab beeldanalyse en vergelijkingen tussen labs. Een belangrijk doel van dit protocol is bedoeld als een werkstroom en hulpmiddelen die tot reproduceerbare resultaten van verschillende labs voor hetzelfde monster leiden moeten.

Afgezien van het normaliseren van de installatiekopie van de analyse, worden de gegevens geproduceerd door deze pijpleiding vastgelegd in een welomschreven, goed geformatteerde bestand¹² geschikt voor gebruik populaire data analyse pakketten^13,14, versoepeling experiment specifieke analyses (zoals aangepaste figuur generatie) en faciliterende gegevensuitwisseling tussen labs.

Dit protocol wordt met name voorgesteld voor onderzoekers die vereisen deeltje shapegegevens, hebben geen toegang tot de inferentiële methoden, niet willen ontwikkelen hun eigen beeld analyse pijpleiding, en willen hun gegevens gemakkelijk delen met anderen

Protocol

1. het verzamelen van monsters voor analyse van het deeltje Vastgesteld wat de omvang van de steekproef voor specifieke reactoren die voldoende deeltjes voor statistische analyse10 produceren zal (> 500) terwijl het vermijden van overlapping van de particle. Ga ervan uit dat een bereik van 0,5 tot 2 mL per monster van het mengsel bevatten voldoende voor actiefslibinstallatie monsters met een mengsel bevatten geschorst vaste stoffen (MLSS) tussen 250 en 5000 mg/L. Ander…

Representative Results

Bestanden die zijn gegenereerdHet proces geïllustreerd in Figuur 1 zal produceren twee bestanden per beeld geanalyseerd. Het eerste bestand is een door komma’s gescheiden waarde (CSV) tekstbestand waarin elke rij komt overeen met een afzonderlijke deeltjes en de kolommen beschrijven verschillende deeltje statistieken zoals gebied, cirkelvormigheid en degelijkheid en omschreven in de handleiding van ImageJ17. Voorb…

Discussion

Hoewel het systeem van de analyse van het beeld vrij robuust is en QC stappen worden genomen om ervoor te zorgen dat slechte afbeeldingen worden verwijderd, kan juiste aandacht op specifieke kwesties in bemonstering, plaat voorbereiding en beeldacquisitie verbeteren, zowel de juistheid van de gegevens en het percentage beelden passeren van QC.

Bemonstering concentratie
Ervan uitgaande dat een representatieve steekproef is genomen, is de belangrijkste stap om ervoor te zorge…

Materials

10% Bleach solution	Chlorox	31009	For workspace disinfection.
15 mL centrifuge tube with cap	Corning	430790	Per sample.
50 mL Erlenmeyer flask	Corning	4980-50	Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing
500 mL Kimax Bottle	Kimble-Chase	14395-50	Or otherwise sufficient for agar handling
Agar	BD	214010	Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample.
Data analysis software	N/A	N/A	R or Python are suggested
Deionized water	N/A	N/A	Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine.
Desktop computer	N/A	N/A	Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient.
External hard drive	Seagate	STEB5000100	Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested.
FIJI	NIH	version 1.51d	Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads
GIT	Open Source	version 2.19.1 or later	Available at: https://git-scm.com/
Image capture software	ToupView	version 3.7.5177	Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data.
Mechanical (X/Y) Stage	OMAX	A512	Not fully required, but greatly aids image acquisition.
Methylene blue	Fisher	M291-100	Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample.
Microscope camera	OMAX	A35140U	Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested.
Optical Stage Micrometer	OMAX	A36CALM1	Or otherwise sufficient for spatial calibration.
Petri dish, 100 mm	Fisher	FB0875712	1 per sample.
PPE	N/A	N/A	Standard lab coat, gloves, and eyewear.
Sparmoria macro	NCSU	version 0.2.1	Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis
Stereo/dissecting microscope	Nikon	SMZ-2T	Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD.