ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化
Summary
このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から肝細胞様細胞を18日間で効率的に生成する単層、血清フリー法を詳細に述べている。これは、hPSCが肝細胞様細胞を形成する前に、原始的な筋、決定的な内因性内因性、後部前腸および肝芽前駆体のような中間細胞型に順次分化するように6つのステップを伴う。
Abstract
肝臓は有害物質を破壊し、重要なタンパク質を分泌し、重要な代謝活動を実行し、生命を維持します。その結果、慢性アルコール摂取、肝炎、急性中毒、またはその他の侮辱によって引き起こされる肝不全は、出血、黄疸、昏睡、そして最終的に死亡する可能性のある重篤な状態である。しかし、肝不全を治療するアプローチは、肝機能や疾患の研究と同様に、ヒト肝細胞の豊富な供給の欠如によって部分的にスタイミクされています。この目的のために、このプロトコルは、肝細胞様細胞へのヒト多能性幹細胞(hPSC)の効率的な分化を詳細に説明し、6つの連続した分化ステップにわたって肝臓の運命がどのように指定されるかを説明する発達ロードマップによって導かれる。発達シグナル伝達経路を操作して肝臓分化を促進し、望ましくない細胞の形成を明示的に抑制することにより、この方法は6日目までにヒト肝芽前駆体および肝細胞様細胞の集団を効率的に生成する。PSC分化の18とそれぞれ。これは、血清フリー培養培地における低分子および成長因子によって発揮される発達シグナル伝達経路の時間的に正確な制御を通じて達成される。このシステムの分化は単層で起こり、特徴的な肝細胞酵素を発現し、慢性肝不全のマウスモデルを生着させる能力を有する肝細胞様細胞を生み出す。インビトロで多数のヒト肝細胞を効率的に生成する能力は、肝不全の治療、薬物スクリーニング、肝疾患の機械的研究に影響を及ぼす。
Introduction
このプロトコルの目的は、ヒト多能性幹細胞(hPSC)を肝臓芽前駆体および肝細胞様細胞2の濃縮集団に効率的に分化することである。ヒト肝前駆体および肝細胞様細胞の準備が整った供給へのアクセスは、肝機能および疾患を調査する努力を加速し、肝不全のための新しい細胞移植療法を可能にする3、4、 5.hPSC(胚性および誘導多能性幹細胞を含む)は、人体のすべての細胞型に分化することができるので、これは過去に困難であることが証明されています。その結果、肝細胞6のような単一細胞型の純粋な集団に排他的に区別することは困難であった。
hPSCを肝細胞に正確に区別するには、まず肝細胞がどのように指定されているのかだけでなく、非肝細胞型がどのように発達するかを理解することが重要です。非肝細胞がどのように発達するかについての知識は、分化中の非肝系統の形成を論理的に抑制するために重要であり、それによって排他的に肝運命2に向かってhPSCを導く。第二に、hPSCが肝臓の運命に向かって区別する複数の発達ステップを記述することが不可欠です。hPSCは、肝細胞様細胞(HEP)を形成する前に、原始的な筋(APS)、決定的内皮(DE)、後前駆体(PFG)および肝芽前駆体(LB)として知られている複数の細胞型に順次分化することが知られている。以前の研究では、肝臓の運命を指定するシグナルと、各発達系統選択2における代替非肝細胞型(胃、膵臓、腸前駆体を含む)の形成を抑制するシグナルを明らかにした。7,8.
これらの洞察は、これらの洞察は、原始的な筋、決定的な内因性、後頭蓋、肝臓芽前駆体、および最後に、肝細胞様細胞2に向かってhPSCを区別する血清フリー、単層法を生み出した。全体的に、この方法は、適切な密度で単層におけるhPSCの播種を含み、6つの分化媒体(様々な発達シグナル伝達経路を調節する成長因子および低分子を含む)を調製し、およびこれらのメディアを順次追加して、18日間にわたって差別化を誘導します。プロセス中に、細胞の通過は必要ありません。なお、この方法は非肝細胞型の形成を抑制するシグナルを明示的に含んでいるため、この分化アプローチ1は、現存する細胞と比較して肝前駆細胞および肝細胞様細胞をより効率的に生成する。分化方法2,9,10,11,12.さらに、このテキストに記載されているプロトコルは、最終的に他のプロトコル9、10によって生成されるものよりも高いレベルの肝転写因子および酵素を発現する肝細胞のより速い生成を可能にする,11歳,12.
ここで説明するプロトコルは、現在の差別化プロトコルに対して一定の利点があります。第1に、hPSCの単層分化を伴い、これは、胚体13に依存するもののような3次元分化方法と比較して技術的に単純である。第二に、この方法は、決定的な内皮細胞(肝細胞の早期前駆体)がhPSC分化2、7の2日以内に効率的かつ迅速に生成することができるという最近の進歩を利用し、その後のことが可能になる。増加した純度を有する肝細胞の産生。第三に、並べて比較すると、この方法2によって産生される肝細胞様細胞は、より多くのALBUMINを産生し、他の方法で産生される肝細胞と比較して肝転写因子および酵素のより高いレベルを発現する10、 11、12.
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法は、hPSCから肝臓芽前駆体、および続いて肝細胞様細胞の濃縮集団の生成を可能にする。ヒト肝細胞の濃縮集団を生成する能力は、このような細胞の実用的な利用のために重要である。hPSCから肝細胞を生成する以前の方法は、げっ歯類への移植時に、肝臓組織15に加えて骨および軟骨を得た肝臓および非肝細胞の両方を含む不純な細胞集団を得た。したがって、非肝…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、Bingリムに対する議論と、インフラ支援のための幹細胞生物学&再生医療スタンフォード研究所に感謝します。この研究は、カリフォルニア再生医療研究所(DISC2-10679)とスタンフォードUCバークレーシーベル幹細胞研究所(L.T.A.およびK.M.L.)とスタンフォードベックマン分子遺伝医学センターと匿名によって支援されました。バクスターとディジェノバの家族(K.M.L.へ)。
Materials
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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